अनुक्रम संयोजन: Difference between revisions

जैव सूचना विज्ञान में, '''अनुक्रम असेंबली''' का तात्पर्य मूल अनुक्रम के पुनर्निर्माण के लिए [[अनुक्रम संरेखण]] और लंबे [[डीएनए]] अनुक्रम से टुकड़ों को संरेखित करना और विलय करना है। इसकी आवश्यकता है क्योंकि डीएनए अनुक्रमण विधि एक बार में पूरे [[जीनोम]] को '''<nowiki/>'पढ़ने'''' में सक्षम नहीं हो सकती है, किंतु उपयोग की गई विधि के आधार पर 20 से 30,000 आधारों के मध्य के छोटे टुकड़ों को पढ़ती है। सामान्यतः, छोटे टुकड़े (रीड्स) शॉटगन अनुक्रमण जीनोम डीएनए, या [[ प्रतिलेखन (आनुवांशिकी) |प्रतिलेखन (आनुवांशिकी)]] ([[व्यक्त अनुक्रम टैग]]) से उत्पन्न होते हैं।

अनुक्रम संयोजन की समस्या की तुलना किसी पुस्तक की कई प्रतियां लेने, उनमें से प्रत्येक को एक अलग कटर के साथ श्रेडर से गुजारने और कटे हुए टुकड़ों को देखकर पुस्तक के पाठ को वापस एक साथ जोड़ने से की जा सकती है। इस कार्य की स्पष्ट कठिनाई के अतिरिक्त, कुछ अतिरिक्त व्यावहारिक मुद्दे भी हैं: मूल में कई दोहराए गए पैराग्राफ हो सकते हैं, और टाइपो त्रुटियों के लिए श्रेडिंग के समय कुछ टुकड़ों को संशोधित किया जा सकता है। किसी अन्य पुस्तक के अंश भी इसमें जोड़े जा सकते हैं और कुछ अंश पूरी तरह से पहचानने योग्य नहीं हो सकते हैं।

पहला अनुक्रम असेंबलर 1980 के दशक के अंत और 1990 के दशक की शुरुआत में [[डीएनए सीक्वेंसर]] कहे जाने वाले स्वचालित अनुक्रमण उपकरणों द्वारा उत्पन्न बड़ी मात्रा में टुकड़ों को एक साथ जोड़ने के लिए सरल अनुक्रम संरेखण कार्यक्रमों के वेरिएंट के रूप में दिखाई देने लगा। जैसे-जैसे अनुक्रमित जीवों का आकार और जटिलता बढ़ती गई ([[प्लाज्मिड्स]] पर छोटे [[वायरस]] से लेकर [[ जीवाणु |जीवाणु]] और अंततः [[ यूकैर्योसाइटों |यूकैर्योसाइटों]] तक), इन [[जीनोम परियोजना]]ओं में उपयोग किए जाने वाले असेंबली कार्यक्रमों को संभालने के लिए तेजी से परिष्कृत रणनीतियों की आवश्यकता थी:

पहले बड़े यूकेरियोटिक जीनोम - 2000 में फल मक्खी [[ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर]] और ठीक एक साल पश्चात् मानव जीनोम - को असेंबल करने की चुनौती का सामना करते हुए, वैज्ञानिकों ने सेलेरा असेंबलर जैसे असेंबलर विकसित किए<ref>{{cite journal|title=ड्रोसोफिला की एक संपूर्ण-जीनोम असेंबली|journal=Science |volume=287 |issue=5461 |pages=2196–204 |date=March 2000 |pmid=10731133 |doi=10.1126/science.287.5461.2196|last1=Myers|first1=E. W.|last2=Sutton|first2=GG|last3=Delcher|first3=AL|last4=Dew|first4=IM|last5=Fasulo|first5=DP|last6=Flanigan|first6=MJ|last7=Kravitz|first7=SA|last8=Mobarry|first8=CM|last9=Reinert|first9=KH|last10=Remington |first10=K. A. |last11=Anson |first11=E. L. |last12=Bolanos |first12=R. A. |last13=Chou |first13=H. H. |last14=Jordan |first14=C. M. |last15=Halpern |first15=A. L. |last16=Lonardi |first16=S |last17=Beasley |first17=E. M. |last18=Brandon |first18=R. C. |last19=Chen |first19=L |last20=Dunn |first20=P. J. |last21=Lai |first21=Z |last22=Liang |first22=Y |last23=Nusskern |first23=D. R. |last24=Zhan |first24=M |last25=Zhang |first25=Q |last26=Zheng |first26=X |last27=Rubin |first27=G. M. |last28=Adams |first28=M. D. |last29=Venter |first29=J. C. |display-authors=8 |bibcode=2000Sci...287.2196M |citeseerx=10.1.1.79.9822 |s2cid=6049420 }}</ref> और अर्चन<ref>{{cite journal |title=ARACHNE: a whole-genome shotgun assembler |journal= Genome Research|volume=12 |issue=1 |pages=177–89 |date=January 2002 |pmid=11779843 |pmc=155255 |doi=10.1101/gr.208902 |last1=Batzoglou |first1=S. |last2=Jaffe |first2=DB |last3=Stanley |first3=K |last4=Butler |first4=J |last5=Gnerre |first5=S |last6=Mauceli |first6=E |last7=Berger |first7=B |author7-link= Bonnie Berger |last8=Mesirov |first8=JP |last9=Lander |first9=ES}}</ref> 130 मिलियन (उदाहरण के लिए, फल मक्खी डी. मेलानोगास्टर) से 3 बिलियन (उदाहरण के लिए, मानव जीनोम) आधार जोड़े के जीनोम को संभालने में सक्षम। इन प्रयासों के पश्चात्, कई अन्य समूहों ने, अधिकतर प्रमुख जीनोम अनुक्रमण केंद्रों पर, बड़े पैमाने पर असेंबलर बनाए, और एक खुला स्रोत प्रयास जिसे एएमओएस के नाम से जाना जाता है<ref>{{Cite web|title=हमें विकी पसंद है|url=https://amos.sourceforge.net/wiki/index.php/AMOS|access-date=2023-01-02|website=amos.sourceforge.net}}</ref> [[ खुला स्रोत सॉफ्टवेयर |खुला स्रोत सॉफ्टवेयर]] ढांचे के अनुसार जीनोम असेंबली विधि में सभी नवाचारों को एक साथ लाने के लिए लॉन्च किया गया था।

[[ व्यक्त अनुक्रम टैग | व्यक्त अनुक्रम टैग]] या ईएसटी असेंबली एक प्रारंभिक रणनीति थी, जो 1990 के दशक के मध्य से लेकर 2000 के दशक के मध्य तक, पूरे जीनोम के अतिरिक्त व्यक्तिगत जीन को इकट्ठा करने के लिए थी। समस्या कई मायनों में जीनोम असेंबली से भिन्न है। ईएसटी असेंबली के लिए इनपुट अनुक्रम एक कोशिका के लिखित [[मैसेंजर आरएनए]] के टुकड़े हैं और पूरे जीनोम के केवल एक उपसमूह का प्रतिनिधित्व करते हैं। जीनोम और ईएसटी असेंबली के मध्य कई एल्गोरिथम संबंधी समस्याएं भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, जीनोम में अधिकांशतः बड़ी मात्रा में दोहराव वाले अनुक्रम होते हैं, जो इंटरजेनिक क्षेत्रों में केंद्रित होते हैं। प्रतिलेखित जीन में बहुत कम दोहराव होते हैं, जिससे संयोजन कुछ सीमा तक आसान हो जाता है। दूसरी ओर, कुछ जीनों को बहुत अधिक संख्या में व्यक्त (प्रतिलेखित) किया जाता है (उदाहरण के लिए, [[हाउसकीपिंग जीन]]), जिसका अर्थ है कि पूरे जीनोम शॉटगन अनुक्रमण के विपरीत, रीड्स को पूरे जीनोम में समान रूप से नमूना नहीं किया जाता है।

# मानचित्रण/संरेखित करना: रीड्स को एक टेम्प्लेट (AKA संदर्भ) के विरुद्ध संरेखित करके असेंबल करना। एकत्रित सर्वसम्मति टेम्पलेट के समान नहीं हो सकती है।

# संदर्भ-निर्देशित: संदर्भ के अंदर सबसे समान क्षेत्र की समानता के आधार पर पठन का समूहन (चरणवार मानचित्रण)। फिर प्रत्येक समूह में पढ़े गए पाठों को लघु पाठ्य गुणवत्ता की नकल करने के लिए छोटा कर दिया जाता है। ऐसा करने की एक विशिष्ट विधि [[ के-अधिक |के-अधिक]] दृष्टिकोण है। तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण|लांग-रीड्स का उपयोग करके संदर्भ-निर्देशित असेंबली सबसे उपयोगी है।

संदर्भित-निर्देशित असेंबली अन्य प्रकारों का एक संयोजन है। इस प्रकार को बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण लाभ (अर्थात कॉल गुणवत्ता) की नकल करने के लिए लंबे समय तक पढ़ी जाने वाली अनुक्रमणिका पर प्रयुक्त किया जाता है। इसके पीछे तर्क संदर्भ के अंदर छोटी विंडो द्वारा रीड्स को समूहीकृत करना है। उच्चतम गुणवत्ता और सबसे संभावित सन्निहित (कॉन्टिग) का चयन करने के लिए के-मात्र दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रत्येक समूह में रीड्स को आकार में कम किया जाएगा। फिर एक मचान बनाने के लिए कॉन्टिग्स को एक साथ जोड़ा जाएगा। अंतिम सहमति मचान में किसी भी अंतराल को बंद करके बनाई जाती है।

* ओवरलैप/लेआउट/आम सहमति (ओएलसी) दृष्टिकोण, जो सेंगर-डेटा असेंबलरों के लिए विशिष्ट था और एक ओवरलैप ग्राफ़ पर निर्भर करता है।

* लालची ग्राफ़-आधारित दृष्टिकोण, जो OLC या DBG दृष्टिकोणों में से किसी एक का भी उपयोग कर सकता है। लालची ग्राफ-आधारित एल्गोरिदम के साथ, contigs लालची विस्तार से आगे बढ़ें, सदैव उच्चतम स्कोरिंग ओवरलैप का पालन करके जो पढ़ा जाता है उसे लेते रहें।<ref>{{Cite journal|last1=Miller|first1=Jason R.|last2=Koren|first2=Sergey|last3=Sutton|first3=Granger|date=2010-03-06|title=अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा के लिए असेंबली एल्गोरिदम|journal=Genomics|language=en|volume=95|issue=6|pages=315–327|doi=10.1016/j.ygeno.2010.03.001|pmc=2874646|pmid=20211242}}</ref>

परिचय में कटी हुई किताबों से की गई तुलना का जिक्र करते हुए: जबकि असेंबली मानचित्रण के लिए टेम्पलेट के रूप में एक बहुत ही समान पुस्तक होगी (संभवतः मुख्य पात्रों के नाम और कुछ स्थानों को बदल दिया गया है), डे-नोवो असेंबली एक और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रस्तुत करती है इसमें चुनौती यह है कि किसी को पहले से पता नहीं चलेगा कि यह एक विज्ञान पुस्तक, एक उपन्यास, एक कैटलॉग या यहां तक ​​​​कि कई किताबें बन जाएंगी। साथ ही, प्रत्येक टुकड़े की तुलना हर दूसरे टुकड़े से की जाएगी।

डे-नोवो असेंबली में दोहराव को संभालने के लिए निकटतम दोहराव का प्रतिनिधित्व करने वाले ग्राफ़ सिद्धांत के निर्माण की आवश्यकता होती है। इस तरह की जानकारी पूर्ण या शॉटगन_सीक्वेंसिंग#पेयर्ड-एंड_सीक्वेंसिंग में दोहराव को कवर करने वाले एक लंबे टुकड़े को पढ़ने से प्राप्त की जा सकती है। दूसरी ओर, मानचित्रण असेंबली में, कई या बिना मिलान वाले भागों को सामान्यतः किसी अन्य संयोजन विधि पर गौर करने के लिए छोड़ दिया जाता है।<ref>{{cite web |last1=Wolf |first1=Beat |title=डे नोवो जीनोम असेंबली बनाम एक संदर्भ जीनोम की मैपिंग|url=http://beat.wolf.home.hefr.ch/documents/prague.pdf |website=University of Applied Sciences Western Switzerland |access-date=6 April 2019}}</ref>

सामान्यतः, अनुक्रमण को एक मचान में इकट्ठा करने में तीन चरण होते हैं:

ए) गुणवत्ता जांच: अनुक्रमण विधि के प्रकार के आधार पर, विभिन्न त्रुटियां उत्पन्न हो सकती हैं जो गलत [[बेस कॉलिंग]] का कारण बन सकती हैं। उदाहरण के लिए, NAAAAAAAAAAAAN और NAAAAAAAAAAAAN का अनुक्रम जिसमें 12 एडेनिन सम्मिलित है, को गलत तरीके से इसके अतिरिक्त 11 एडेनिन कहा जा सकता है। लक्ष्य डीएनए/आरएनए के अत्यधिक दोहराव वाले खंड को अनुक्रमित करने के परिणामस्वरूप एक छोटी या एक अधिक आधार वाली कॉल हो सकती है। पढ़ने की गुणवत्ता सामान्यतः Phred गुणवत्ता स्कोर द्वारा मापी जाती है जो कि पढ़ने के अनुक्रम के अंदर प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड गुणवत्ता का एक एन्कोडेड स्कोर है। कुछ अनुक्रमण विधि ों जैसे [[ पचबियो |पचबियो]] में उनके अनुक्रमित पढ़ने के लिए कोई स्कोरिंग विधि नहीं है। इस चरण में उपयोग किया जाने वाला एक सामान्य उपकरण FastQC है।<ref>{{Cite web |title=बब्राहम जैव सूचना विज्ञान - फास्टक्यूसी उच्च थ्रूपुट अनुक्रम डेटा के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण उपकरण|url=https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |access-date=2022-05-09 |website=www.bioinformatics.babraham.ac.uk}}</ref> बी) रीड्स को फ़िल्टर करना: जो रीड्स गुणवत्ता जांच पास करने में विफल रहे, उन्हें सर्वोत्तम असेंबली कॉन्टिग्स प्राप्त करने के लिए फास्टक्यू फ़ाइल से हटा दिया जाना चाहिए।

==विधि ी परिवर्तनों का प्रभाव==

सेंगर विधि के साथ, 20,000 से 200,000 रीड वाले बैक्टीरियल प्रोजेक्ट आसानी से एक कंप्यूटर पर इकट्ठे किए जा सकते हैं। लगभग 35 मिलियन रीड्स वाले मानव जीनोम जैसी बड़ी परियोजनाओं के लिए बड़े कंप्यूटिंग फार्म और वितरित कंप्यूटिंग की आवश्यकता होती है।

2006 से, [[इलुमिना (कंपनी)]] (पहले सोलेक्सा) विधि उपलब्ध है और एक अनुक्रमण मशीन पर प्रति रन लगभग 100 मिलियन रीड्स उत्पन्न कर सकती है। इसकी तुलना मानव जीनोम परियोजना के 35 मिलियन रीड्स से करें, जिसे सैकड़ों अनुक्रमण मशीनों पर तैयार करने में कई वर्षों की आवश्यकता थी। इलुमिना प्रारंभ में केवल 36 आधारों की लंबाई तक सीमित थी, जिससे यह डे नोवो असेंबली (जैसे कि डे नोवो ट्रांस्क्रिप्टोम असेंबली) के लिए कम उपयुक्त थी, किन्तु प्रौद्योगिकी के नए पुनरावृत्तियों ने 3-400बीपी क्लोन के दोनों सिरों से 100 बेस से ऊपर पढ़ने की लंबाई प्राप्त की। . 2007 के अंत में SHARCGS असेंबलर की घोषणा की गई<ref>{{cite journal |title=SHARCGS, डे नोवो जीनोमिक अनुक्रमण के लिए एक तेज़ और अत्यधिक सटीक शॉर्ट-रीड असेंबली एल्गोरिदम|journal=Genome Research|volume=17 |issue=11 |pages=1697–706 |date=November 2007 |pmid=17908823 |pmc=2045152 |doi=10.1101/gr.6435207 |last1=Dohm |first1=J. C. |last2=Lottaz |first2=C. |last3=Borodina |first3=T. |last4=Himmelbauer |first4=H.}}</ref> डोहम एट अल द्वारा। पहला प्रकाशित असेंबलर था जिसका उपयोग सोलेक्सा रीड्स के साथ असेंबली के लिए किया गया था। इसका तुरंत कई अन्य लोगों ने अनुसरण किया।

पश्चात् में, [[एप्लाइड बायोसिस्टम्स]] से [[एबीआई ठोस अनुक्रमण]], [[आयन टोरेंट]] और एसएमआरटी सीक्वेंसिंग जैसी नई प्रौद्योगिकियां जारी की गईं और नई प्रौद्योगिकियां (जैसे [[ नैनोपोर अनुक्रमण |नैनोपोर अनुक्रमण]] ) उभरती रहीं। इन प्रौद्योगिकियों की उच्च त्रुटि दर के अतिरिक्त वह असेंबली के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि उनकी लंबी पढ़ने की लंबाई दोहराव की समस्या का समाधान करने में सहायता करती है। एक पूर्ण दोहराव के माध्यम से इकट्ठा करना असंभव है जो अधिकतम पढ़ी गई लंबाई से अधिक लंबा है; यद्यपि, जैसे-जैसे पढ़ा जाना लंबा होता जाता है, पूर्ण दोहराव की संभावना उतनी ही बड़ी होती जाती है। इससे लंबे समय [[एसएमआरटी अनुक्रमण]] पढ़ने से दोहराव को इकट्ठा करने में लाभ मिलता है, यदि उनकी त्रुटिहीनता कम हो (~ 85%)।

विभिन्न जीवों के जीनोम के अंदर उच्च जटिलता का एक विशिष्ट क्षेत्र होता है। इसलिए, विभिन्न कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण की आवश्यकता है। सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले कुछ एल्गोरिदम हैं:

* ग्राफ असेंबली: कंप्यूटर विज्ञान में ग्राफ सिद्धांत पर आधारित है। डी ब्रुइज़न ग्राफ़ इस दृष्टिकोण का एक उदाहरण है और रीड्स से सन्निहित को इकट्ठा करने के लिए के-मर्स का उपयोग करता है।

अनुक्रम खंडों के एक समूह को देखते हुए, वस्तु को एक लंबा अनुक्रम ढूंढना है जिसमें सभी टुकड़े सम्मिलित हों (अनुक्रम असेंबली के प्रकार के अनुसार चित्र देखें):

# चरण 2 और 3 को तब तक दोहराएँ जब तक कि केवल एक टुकड़ा न रह जाए।

|यह एक सामान्य उपकरण है जिसका उपयोग [[Illumina, Inc.|इलुमिना]], [[454 Life Sciences|454]] और [[Pacific Biosciences|PacBio]] जैसी विभिन्न अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों से रीड्स की गुणवत्ता की जांच करने के लिए किया जाता है।