निर्देशित विकास: Difference between revisions
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{{Short description|Protein engineering method}} | {{Short description|Protein engineering method}} | ||
{{distinguish| | {{distinguish|निर्देशित विकास (ट्रांसह्यूमनिज्म)}} | ||
[[File:DE cycle.png|thumb|500px|[[विकास]] की तुलना में निर्देशित विकास का उदाहरण। आंतरिक चक्र कोष्ठक में प्राकृतिक प्रक्रिया की | [[File:DE cycle.png|thumb|500px|[[विकास]] की तुलना में निर्देशित विकास का उदाहरण। आंतरिक चक्र कोष्ठक में प्राकृतिक प्रक्रिया की अनुकरण के साथ निर्देशित विकास चक्र के 3 चरणों को इंगित करता है। बाहरी वृत्त विशिष्ट प्रयोग के चरणों को दर्शाता है। लाल प्रतीक कार्यात्मक वेरिएंट को दर्शाते हैं, पीले प्रतीक कम फ़ंक्शन वाले वेरिएंट को दर्शाते हैं।]]'''निर्देशित विकास''' (डीई) [[प्रोटीन]] इंजीनियरिंग में उपयोग की जाने वाली विधि है जो की उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित लक्ष्य की ओर प्रोटीन या [[ न्यूक्लिक अम्ल |न्यूक्लिक अम्ल]] को चलाने के लिए [[प्राकृतिक चयन]] की प्रक्रिया की अनुकरण करती है।<ref name="ReferenceA">{{cite journal | vauthors = Lutz S | title = निर्देशित विकास से परे - अर्ध-तर्कसंगत प्रोटीन इंजीनियरिंग और डिजाइन| journal = Current Opinion in Biotechnology | volume = 21 | issue = 6 | pages = 734–43 | date = December 2010 | pmid = 20869867 | pmc = 2982887 | doi = 10.1016/j.copbio.2010.08.011 }}</ref> इसमें [[जीन]] को उत्परिवर्तन के पुनरावृत्त वृत्त शैल (वेरिएंट की लाइब्रेरी बनाना), चयन (उन वेरिएंट को व्यक्त करना और वांछित फ़ंक्शन के साथ सदस्यों को अलग करना) और प्रवर्धन (अगले वृत्त शैल के लिए टेम्पलेट तैयार करना) के अधीन करना सम्मिलत है। इसे [[रहना|विवो]] (जीवित जीवों में), या [[ कृत्रिम परिवेशीय |कृत्रिम परिवेशीय]] (कोशिकाओं में या मुक्त समाधान में) किया जा सकता है। निर्देशित विकास का उपयोग प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए [[तर्कसंगत डिजाइन]] संशोधित प्रोटीन के विकल्प के रूप में, साथ ही नियंत्रित, प्रयोगशाला वातावरण में मौलिक विकास के प्रयोगात्मक विकास अध्ययन के लिए किया जाता है। | ||
== इतिहास == | == इतिहास == | ||
निर्देशित विकास की उत्पत्ति 1960 के दशक में हुई<ref name=":0">{{cite journal | vauthors = Cobb RE, Chao R, Zhao H | title = Directed Evolution: Past, Present and Future | journal = AIChE Journal | volume = 59 | issue = 5 | pages = 1432–1440 | date = May 2013 | pmid = 25733775 | pmc = 4344831 | doi = 10.1002/aic.13995 }}</ref> | इस प्रकार से निर्देशित विकास की उत्पत्ति 1960 के दशक में हुई थी।<ref name=":0">{{cite journal | vauthors = Cobb RE, Chao R, Zhao H | title = Directed Evolution: Past, Present and Future | journal = AIChE Journal | volume = 59 | issue = 5 | pages = 1432–1440 | date = May 2013 | pmid = 25733775 | pmc = 4344831 | doi = 10.1002/aic.13995 }}</ref> अतः "स्पीगेलमैन्स मॉन्स्टर" प्रयोग में आरएनए के विकास के साथ किया है।<ref name="An extracellular Darwinian experime">{{cite journal | vauthors = Mills DR, Peterson RL, Spiegelman S | title = स्व-डुप्लिकेटिंग न्यूक्लिक एसिड अणु के साथ एक बाह्य कोशिकीय डार्विनियन प्रयोग| journal = Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | volume = 58 | issue = 1 | pages = 217–24 | date = July 1967 | pmid = 5231602 | pmc = 335620 | doi = 10.1073/pnas.58.1.217 | bibcode = 1967PNAS...58..217M | doi-access = free }}</ref> इस अवधारणा को चयन दबाव के अधीन बैक्टीरिया के विकास के माध्यम से प्रोटीन विकास तक बढ़ाया गया था जो इसके जीनोम में एकल जीन के विकास का पक्षधर था।<ref>{{cite journal | vauthors = Hall BG | title = एक नए एंजाइमेटिक फ़ंक्शन का प्रायोगिक विकास। द्वितीय. ई. कोलाई में ईबीजी एंजाइम के लिए कई कार्यों का विकास| journal = Genetics | volume = 89 | issue = 3 | pages = 453–65 | date = July 1978 | doi = 10.1093/genetics/89.3.453 | pmid = 97169 | pmc = 1213848 }}</ref> | ||
किन्तु1980 के दशक में प्रारंभिक चरण प्रदर्शन तकनीकों ने एकल प्रोटीन में उत्परिवर्तन और चयन को लक्षित करने की अनुमति दी थी।<ref>{{cite journal | vauthors = Smith GP | title = Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface | journal = Science | volume = 228 | issue = 4705 | pages = 1315–7 | date = June 1985 | pmid = 4001944 | doi = 10.1126/science.4001944 | bibcode = 1985Sci...228.1315S }}</ref> इसने उन्नत [[ बाध्यकारी प्रोटीन |बाध्यकारी प्रोटीन]] के चयन को सक्षम किया, किन्तु [[एंजाइम]] की उत्प्रेरक गतिविधि के चयन के साथ अभी तक संगत नहीं था।<ref>{{Cite journal |last1=Chen|first1=Keqin|last2=Arnold|first2=Frances H. | name-list-style = vanc |date=1991|title=Enzyme Engineering for Nonaqueous Solvents: Random Mutagenesis to Enhance Activity of Subtilisin E in Polar Organic Media|journal=Bio/Technology|language=En|volume=9|issue=11|pages=1073–1077|doi=10.1038/nbt1191-1073|pmid=1367624|s2cid=12380597|issn=0733-222X}}</ref> एंजाइमों को विकसित करने के विधि 1990 के दशक में विकसित किए गए और इस तकनीक को व्यापक वैज्ञानिक दर्शकों तक पहुंचाया गया था।<ref>{{Cite journal|last=Kim|first=Eun-Sung|date=2008-11-27|title=Directed Evolution: A Historical Exploration into an Evolutionary Experimental System of Nanobiotechnology, 1965–2006|journal=Minerva|language=en|volume=46|issue=4|pages=463–484|doi=10.1007/s11024-008-9108-9|s2cid=55845851|issn=0026-4695}}</ref> जीन वेरिएंट की लाइब्रेरी बनाने और उनकी गतिविधि की स्क्रीनिंग के लिए नए विधियो के साथ क्षेत्र का तीव्रता से विस्तार हुआ था।<ref name=":0" /><ref>{{cite journal | vauthors = Packer MS, Liu DR | title = प्रोटीन के निर्देशित विकास के तरीके| language = En | journal = Nature Reviews. Genetics | volume = 16 | issue = 7 | pages = 379–94 | date = July 2015 | pmid = 26055155 | doi = 10.1038/nrg3927 | s2cid = 205486139 }}</ref> निर्देशित विकास विधियों के विकास को 2018 में एंजाइमों के विकास के लिए [[फ्रांसिस अर्नोल्ड]] और फेज प्रदर्शन के लिए [[जॉर्ज स्मिथ (रसायनज्ञ)]] और [[ग्रेगरी विंटर]] को [[रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार]] देकर सम्मानित किया गया था।<ref>{{Cite web|url=https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2018/summary/|title=The Nobel Prize in Chemistry 2018|website=NobelPrize.org|language=en-US|access-date=2018-10-03}}</ref> | |||
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==सिद्धांत== | ==सिद्धांत== | ||
[[File:DE landscape.png|thumb|left|300px|निर्देशित विकास '[[फिटनेस परिदृश्य]]' पर पहाड़ी पर चढ़ने के समान है जहां ऊंचाई वांछित संपत्ति का प्रतिनिधित्व करती है। चयन का प्रत्येक | [[File:DE landscape.png|thumb|left|300px|निर्देशित विकास '[[फिटनेस परिदृश्य]]' पर पहाड़ी पर चढ़ने के समान है जहां ऊंचाई वांछित संपत्ति का प्रतिनिधित्व करती है। चयन का प्रत्येक वृत्त शैल प्रारंभ टेम्पलेट (1) के सभी किनारों पर उत्परिवर्ती का नमूना लेता है और उच्चतम ऊंचाई वाले उत्परिवर्ती का चयन करता है, जिससे पहाड़ी पर चढ़ जाता है। इसे तब तक दोहराया जाता है जब तक कि स्थानीय शिखर तक नहीं पहुंच जाता (2) है।]]निर्देशित विकास प्रयोगशाला स्थापना में प्राकृतिक विकास चक्र की अनुकरण है। विकास के लिए तीन चीजों की आवश्यकता होती है: प्रतिकृतियों के मध्य [[आनुवंशिक विविधता]], यह भिन्नता फिटनेस (जीव विज्ञान) का कारण बनती है जिस पर चयन कार्य करता है, और यह भिन्नता आनुवंशिकता है। डीई में, एकल जीन उत्परिवर्तन, चयन या स्क्रीनिंग और प्रवर्धन के पुनरावृत्त वृत्त शैल द्वारा विकसित होता है।<ref>{{cite book | vauthors = Voigt CA, Kauffman S, Wang ZG | title = विकासवादी प्रोटीन डिजाइन| chapter = Rational evolutionary design: the theory of in vitro protein evolution | journal = Advances in Protein Chemistry | volume = 55 | pages = 79–160 | date = 2000 | pmid = 11050933 | doi = 10.1016/s0065-3233(01)55003-2 | isbn = 9780120342556 }}</ref> इन चरणों के राउंड सामान्यतः दोहराए जाते हैं, चरणबद्ध सुधार प्राप्त करने के लिए अगले राउंड के लिए टेम्पलेट के रूप में राउंड से सर्वोत्तम संस्करण का उपयोग किया जाता है। | ||
एक निर्देशित विकास प्रयोग में सफलता की संभावना सीधे कुल | एक निर्देशित विकास प्रयोग में सफलता की संभावना सीधे कुल लाइब्रेरी आकार से संबंधित है, क्योंकि अधिक म्यूटेंट का मूल्यांकन करने से वांछित गुणों के साथ को खोजने की संभावना बढ़ जाती है।<ref>{{cite journal | vauthors = Dalby PA | title = एंजाइमों के निर्देशित विकास के लिए रणनीति और सफलता| journal = Current Opinion in Structural Biology | volume = 21 | issue = 4 | pages = 473–80 | date = August 2011 | pmid = 21684150 | doi = 10.1016/j.sbi.2011.05.003 }}</ref> | ||
===विभिन्नता उत्पन्न करना=== | ===विभिन्नता उत्पन्न करना=== | ||
[[File:DE Mutations.png|thumb|300px|प्रारंभिक जीन (बाएं) और वेरिएंट की लाइब्रेरी (दाएं)। [[बिंदु उत्परिवर्तन]] एकल न्यूक्लियोटाइड को | [[File:DE Mutations.png|thumb|300px|प्रारंभिक जीन (बाएं) और वेरिएंट की लाइब्रेरी (दाएं)। [[बिंदु उत्परिवर्तन]] एकल न्यूक्लियोटाइड को परिवर्तन ते हैं। डीएनए के अनुभागों को जोड़ें या हटाएं। [[आनुवंशिक पुनर्संयोजन]] दो (या अधिक) समान जीनों के खंडों को पुनः संयोजित करता है।]]अतः फ़ाइल: कैसे यादृच्छिक डीएनए लाइब्रेरी नमूना [[अनुक्रम स्थान]].पीडीएफ अंगूठा कैसे लाइब्रेरी (जीव विज्ञान) उत्परिवर्तन (आणविक जीव विज्ञान तकनीक) द्वारा उत्पन्न होता है या रैंडम उत्परिवर्तन नमूना अनुक्रम स्थान है। किसी दिए गए स्थान पर प्रतिस्थापित अमीनो एसिड दिखाया गया है। प्रत्येक बिंदु या जुड़े बिंदुओं का सेट लाइब्रेरी का सदस्य है। त्रुटि-प्रवण पीसीआर यादृच्छिक रूप से कुछ अवशेषों को अन्य अमीनो एसिड में परिवर्तन कर देता है। एलेनिन स्कैनिंग प्रोटीन के प्रत्येक अवशेष को एक-एक करके एलेनिन से परिवर्तन देती है। अतः साइट संतृप्ति 20 संभावित अमीनो एसिड (या उनमें से कुछ उपसमूह) में से प्रत्येक को एक-एक करके ही स्थान पर प्रतिस्थापित करती है। | ||
निर्देशित विकास के चक्र को निष्पादित करने में | निर्देशित विकास के चक्र को निष्पादित करने में प्रथम चरण भिन्न जीनों की लाइब्रेरी का निर्माण है। यादृच्छिक अनुक्रम के लिए अनुक्रम स्थान विशाल है(100 अमीनो एसिड प्रोटीन के लिए 10130 संभावित अनुक्रम) और कार्यात्मक प्रोटीन द्वारा अधिक कम जनसँख्या है। न तो प्रयोगात्मक,<ref name="Lipovsek D 2004">{{cite journal | vauthors = Lipovsek D, Plückthun A | title = राइबोसोम डिस्प्ले और एमआरएनए डिस्प्ले द्वारा इन-विट्रो प्रोटीन विकास| journal = Journal of Immunological Methods | volume = 290 | issue = 1–2 | pages = 51–67 | date = July 2004 | pmid = 15261571 | doi = 10.1016/j.jim.2004.04.008 }}</ref> न ही प्राकृतिक<ref name="Dryden DT 2008">{{cite journal | vauthors = Dryden DT, Thomson AR, White JH | title = How much of protein sequence space has been explored by life on Earth? | journal = Journal of the Royal Society, Interface | volume = 5 | issue = 25 | pages = 953–6 | date = August 2008 | pmid = 18426772 | pmc = 2459213 | doi = 10.1098/rsif.2008.0085 }}</ref> विकास कभी भी इतने सारे अनुक्रमों का नमूना लेने के समीप पहुंच सकता है। बेशक, प्राकृतिक विकास नमूने कार्यात्मक प्रोटीन अनुक्रमों के समीप भिन्न अनुक्रमों का नमूना लेते हैं और पहले से ही कार्यात्मक जीन को उत्परिवर्तित करके डीई में इसका अनुकरण किया जाता है। | ||
प्रारंभिक जीन को यादृच्छिक बिंदु उत्परिवर्तन (रासायनिक उत्परिवर्तन या त्रुटि प्रवण पॉलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा) | इस प्रकार से कुछ गणनाओं से पता चलता है कि यह पूर्ण रूप से संभव है कि सभी व्यावहारिक (अर्थात कार्यात्मक और संरचनात्मक) उद्देश्यों के लिए, पृथ्वी पर जीवन के विकास के समय प्रोटीन अनुक्रम स्थान का पूर्ण रूप से पता लगाया गया है।<ref name="Dryden DT 2008" /> | ||
और प्रारंभिक जीन को यादृच्छिक बिंदु उत्परिवर्तन (रासायनिक उत्परिवर्तन या त्रुटि प्रवण पॉलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा) उत्परिवर्तित किया जा सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Kuchner O, Arnold FH | title = एंजाइम उत्प्रेरक का निर्देशित विकास| journal = Trends in Biotechnology | volume = 15 | issue = 12 | pages = 523–30 | date = December 1997 | pmid = 9418307 | doi = 10.1016/s0167-7799(97)01138-4 | doi-access = free }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Sen S, Venkata Dasu V, Mandal B | title = एंजाइम कार्यों में सुधार के लिए निर्देशित विकास में विकास| journal = Applied Biochemistry and Biotechnology | volume = 143 | issue = 3 | pages = 212–23 | date = December 2007 | pmid = 18057449 | doi = 10.1007/s12010-007-8003-4 | s2cid = 32550018 }}</ref> और इंडेल (ट्रांसपोज़न द्वारा)।<ref>{{cite journal | vauthors = Jones DD | title = Triplet nucleotide removal at random positions in a target gene: the tolerance of TEM-1 beta-lactamase to an amino acid deletion | journal = Nucleic Acids Research | volume = 33 | issue = 9 | pages = e80 | date = May 2005 | pmid = 15897323 | pmc = 1129029 | doi = 10.1093/nar/gni077 }}</ref> [[डीएनए फेरबदल|डीएनए परिवर्तन]] द्वारा आनुवंशिक पुनर्संयोजन की अनुकरण की जा सकती है<ref>{{cite journal | vauthors = Stemmer WP | title = डीएनए फेरबदल द्वारा इन विट्रो में प्रोटीन का तेजी से विकास| journal = Nature | volume = 370 | issue = 6488 | pages = 389–91 | date = August 1994 | pmid = 8047147 | doi = 10.1038/370389a0 | bibcode = 1994Natur.370..389S | s2cid = 4363498 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP | title = विभिन्न प्रजातियों के जीनों के एक परिवार के डीएनए में फेरबदल से निर्देशित विकास में तेजी आती है| journal = Nature | volume = 391 | issue = 6664 | pages = 288–91 | date = January 1998 | pmid = 9440693 | doi = 10.1038/34663 | bibcode = 1998Natur.391..288C | s2cid = 4352696 }}</ref> परिवर्तन किए गए मूल जीनों के मध्य अनुक्रम स्थान के क्षेत्रों में सम्मिलित करने के लिए अनेक अनुक्रमों (सामान्यतः 70% से अधिक अनुक्रम पहचान) की है। अंत में, जीन के विशिष्ट क्षेत्रों को व्यवस्थित रूप से यादृच्छिक संरचना और कार्य ज्ञान पर आधारित अधिक केंद्रित दृष्टिकोण के लिए किया जा सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Reetz MT, Carballeira JD | title = कार्यात्मक एंजाइमों के तेजी से निर्देशित विकास के लिए पुनरावृत्त संतृप्ति उत्परिवर्तन (आईएसएम)।| journal = Nature Protocols | volume = 2 | issue = 4 | pages = 891–903 | date = 2007 | pmid = 17446890 | doi = 10.1038/nprot.2007.72 | s2cid = 37361631 }}</ref> किन्तु विधि के आधार पर, उत्पन्न लाइब्रेरी इसमें सम्मिलत फिटनेस प्रभावों के वितरण में भिन्न होती है। तथापि किसी जीव का उपयोग रुचि के जीन को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, केवल उस जीन को उत्परिवर्तित करने से जीव का बाकी जीनोम वही रहता है और विकास प्रयोग के लिए इसे अनदेखा किया जा सकता है (एक निरंतर आनुवंशिक वातावरण प्रदान करने की सीमा तक) है। | |||
===फिटनेस अंतर का पता लगाना=== | ===फिटनेस अंतर का पता लगाना=== | ||
अधिकांश [[उत्परिवर्तन]] हानिकारक होते हैं और इसलिए उत्परिवर्ती | अधिकांश [[उत्परिवर्तन]] हानिकारक होते हैं और इसलिए उत्परिवर्ती लाइब्रेरीों में अधिकतर कम [[उत्प्रेरक गतिविधि]] वाले वेरिएंट होते हैं।<ref>{{cite journal | vauthors = Hartl DL | title = What can we learn from fitness landscapes? | journal = Current Opinion in Microbiology | volume = 21 | pages = 51–7 | date = October 2014 | pmid = 25444121 | pmc = 4254422 | doi = 10.1016/j.mib.2014.08.001 }}</ref> इसलिए, वांछित गुणों में सुधार करने वाले लाभकारी उत्परिवर्तन वाले दुर्लभ वेरिएंट को खोजने के लिए गतिविधि को मापने के लिए उच्च-थ्रूपुट [[परख]] महत्वपूर्ण है। कार्यात्मक वेरिएंट को अलग करने के लिए विधि की दो मुख्य श्रेणियां उपस्तिथ हैं। चयन प्रणालियाँ जीन के जीवित रहने के लिए [[प्रोटीन]] फ़ंक्शन को सीधे जोड़ती हैं, जबकि स्क्रीनिंग प्रणाली व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्रकार की परख करते हैं और वांछित गतिविधि के प्रकार या विभिन्न प्रकार की जनसँख्या को सॉर्ट करने के लिए मात्रात्मक सीमा निर्धारित करने की अनुमति देते हैं। अर्थात चयन और स्क्रीनिंग दोनों को जीवित कोशिकाओं (''इन विवो'' इवोल्यूशन) में किया जा सकता है या बिना किसी कोशिका के सीधे प्रोटीन या आरएनए पर (''इन विट्रो'' इवोल्यूशन) किया जा सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Badran AH, Liu DR | title = विवो में निरंतर निर्देशित विकास| journal = Current Opinion in Chemical Biology | volume = 24 | pages = 1–10 | date = February 2015 | pmid = 25461718 | pmc = 4308500 | doi = 10.1016/j.cbpa.2014.09.040 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Kumar A, Singh S | title = Directed evolution: tailoring biocatalysts for industrial applications | journal = Critical Reviews in Biotechnology | volume = 33 | issue = 4 | pages = 365–78 | date = December 2013 | pmid = 22985113 | doi = 10.3109/07388551.2012.716810 | s2cid = 42821437 }}</ref> | ||
विवो विकास के | इस प्रकार से विवो विकास के समय, प्रत्येक कोशिका (सामान्यतः [[ जीवाणु |जीवाणु]] या [[ ख़मीर |ख़मीर]] ) [[प्लाज्मिड]] के साथ [[परिवर्तन (आनुवांशिकी)]] होती है जिसमें वेरिएंट लाइब्रेरी का अलग सदस्य होता है। इस प्रकार, कोशिकाओं के मध्य केवल रुचि का जीन ही भिन्न होता है, अन्य सभी जीनों को समान रखा जाता है। और कोशिकाएं प्रोटीन को या तो अपने [[ कोशिका द्रव्य |कोशिका द्रव्य]] या [[प्लाज्मा झिल्ली]] में व्यक्त करती हैं जहां इसके कार्य का परीक्षण किया जा सकता है। इस प्रारूप में सेलुलर वातावरण में गुणों का चयन करने का लाभ होता है, जो तब उपयोगी होता है जब विकसित प्रोटीन या आरएनए का उपयोग जीवित जीवों में किया जाना होता है। जब कोशिकाओं के बिना प्रदर्शन किया जाता है, तो डीई में समाधान में प्रोटीन या आरएनए मुक्त उत्पादन करने या [[इन विट्रो कंपार्टमेंटलाइज़ेशन]] में विभाजित करने के लिए इन विट्रो कंपार्टमेंटलाइज़ेशन या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन. 2एफ अनुवाद का उपयोग सम्मिलत होता है। इस विधि में चयन स्थितियों (जैसे तापमान, विलायक) में अधिक बहुमुखी होने का लाभ है, और यह प्रोटीन व्यक्त कर सकता है जो की कोशिकाओं के लिए विषाक्त होती है। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो विकास प्रयोग कहीं अधिक उच्च लाइब्रेरी (10<sup>15</sup> तक) उत्पन्न कर सकते हैं) क्योंकि लाइब्रेरी डीएनए को कोशिकाओं में परिवर्तन (आनुवांशिकी) की आवश्यकता नहीं होती है ((प्रायः एक सीमित चरण) है। | ||
====चयन==== | ====चयन==== | ||
[[ प्रोबूजेन निबंध | प्रोबूजेन | [[ प्रोबूजेन निबंध | प्रोबूजेन गतिविधि]] के लिए चयन अवधारणात्मक रूप से सरल है। किन्तु लक्ष्य अणु को ठोस समर्थन पर स्थिर किया जाता है, विभिन्न प्रोटीनों की लाइब्रेरी को इसके ऊपर प्रवाहित किया जाता है, व्यर्थ बाइंडर्स को धोया जाता है, और शेष बंधे वेरिएंट को उनके जीन को अलग करने के लिए पुनर्प्राप्त किया जाता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Willats WG | title = Phage display: practicalities and prospects | journal = Plant Molecular Biology | volume = 50 | issue = 6 | pages = 837–54 | date = December 2002 | pmid = 12516857 | doi = 10.1023/A:1021215516430 | s2cid = 4960676 }}</ref> सक्रिय उत्प्रेरक को अलग करने के प्रयास के रूप में एंजाइम को स्थिर सहसंयोजक [[एंजाइम अवरोधक]] से बांधने का भी उपयोग किया गया है। चूंकि, यह दृष्टिकोण केवल एकल उत्प्रेरक टर्नओवर के लिए चयन करता है और सब्सट्रेट बाइंडिंग या वास्तविक सब्सट्रेट प्रतिक्रियाशीलता का सही मॉडल नहीं है। यदि किसी महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट को संश्लेषित करके, या किसी विष को नष्ट करके, कोशिका अस्तित्व के लिए एंजाइम गतिविधि को आवश्यक बनाया जा सकता है, तो कोशिका अस्तित्व एंजाइम गतिविधि का कार्य है।<ref name="Leemhuis H 2005">{{cite journal | vauthors = Leemhuis H, Stein V, Griffiths AD, Hollfelder F | title = New genotype–phenotype linkages for directed evolution of functional proteins | journal = Current Opinion in Structural Biology | volume = 15 | issue = 4 | pages = 472–8 | date = August 2005 | pmid = 16043338 | doi = 10.1016/j.sbi.2005.07.006 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Verhoeven KD, Altstadt OC, Savinov SN | title = आनुवंशिक चयन प्रणाली का उपयोग करके साइट-विशिष्ट प्रोटीज का इंट्रासेल्युलर पता लगाना और विकास करना| journal = Applied Biochemistry and Biotechnology | volume = 166 | issue = 5 | pages = 1340–54 | date = March 2012 | pmid = 22270548 | doi = 10.1007/s12010-011-9522-6 | s2cid = 36583382 }}</ref> ऐसी प्रणालियाँ सामान्यतः केवल कोशिकाओं की परिवर्तन (आनुवांशिकी) दक्षता द्वारा थ्रूपुट में सीमित होती हैं। वे स्क्रीनिंग की तुलना में कम बहुमूल्य और श्रम-गहन भी हैं, चूंकि वे सामान्यतः इंजीनियर करने में कठिन होते हैं, और कलाकृतियों से ग्रस्त होते हैं और लाइब्रेरी में उपस्तिथ फिटनेस प्रभावों के वितरण के बारे में कोई जानकारी नहीं देते हैं। | ||
====स्क्रीनिंग==== | ====स्क्रीनिंग==== | ||
चयन का विकल्प स्क्रीनिंग प्रणाली है। प्रत्येक प्रकार का जीन व्यक्तिगत रूप से [[प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैव प्रौद्योगिकी)]] है और गतिविधि को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए | अतः चयन का विकल्प स्क्रीनिंग प्रणाली है। प्रत्येक प्रकार का जीन व्यक्तिगत रूप से [[प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैव प्रौद्योगिकी)]] है और गतिविधि को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए (प्रायः [[रंगीन]] या [[फ्लोरोजेनिक]] उत्पाद द्वारा) परखा जाता है। फिर वेरिएंट को रैंक किया जाता है और प्रयोगकर्ता निर्णय लेता है कि डीई के अगले वृत्त शैल के लिए कौन से वेरिएंट को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करना है। यहां तक कि अधिक उच्च थ्रूपुट परख में सामान्यतः चयन विधियों की तुलना में कम कवरेज होता है, किन्तु स्क्रीन किए गए प्रत्येक वेरिएंट पर विस्तृत जानकारी तैयार करने का लाभ मिलता है। इस अलग-अलग डेटा का उपयोग लाइब्रेरीों में गतिविधियों के वितरण को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है जो कि सरल चयन प्रणालियों में संभव नहीं है। इसलिए, जब अनुकूली विकास और फिटनेस परिदृश्यों को प्रयोगात्मक रूप से चित्रित करने का विचार आता है तो स्क्रीनिंग प्रणाली के लाभ होते हैं। | ||
===आनुवंशिकता सुनिश्चित करना=== | ===आनुवंशिकता सुनिश्चित करना=== | ||
[[File:DE Linkage.png|thumb|350px|एक प्रोटीन | [[File:DE Linkage.png|thumb|350px|एक व्यक्त प्रोटीन को या तो उसके जीन से [[सहसंयोजक बंधन|सहसंयोजक]] रूप से जोड़ा जा सकता है (जैसे कि [[एमआरएनए]], बाएं) या उसके साथ विभाजित किया जा सकता है (कोशिकाएं (जीव विज्ञान) या [[microfluidics|माइक्रोफ्लुइडिक्स]], दाएं)। किसी भी तरह से यह सुनिश्चित होता है कि एन्कोडेड प्रोटीन की गतिविधि के आधार पर जीन को अलग किया जा सकता है।]]जब कार्यात्मक प्रोटीन को अलग कर दिया गया है, तो यह आवश्यक है कि उनके जीन भी अलग हों, इसलिए आनुवंशिकता जीनोटाइप-फेनोटाइप लिंक की आवश्यकता होती है।<ref name="Leemhuis H 2005"/> यह सहसंयोजक हो सकता है, जैसे कि [[एमआरएनए डिस्प्ले]] जहां एमआरएनए जीन पौरोमाइसिन द्वारा अनुवाद के अंत में प्रोटीन से जुड़ा होता है।<ref name="Lipovsek D 2004"/> वैकल्पिक रूप से प्रोटीन और उसके जीन को जीवित कोशिकाओं में विभाजित करके सह-स्थानीयकृत किया जा सकता है<ref>{{cite journal | vauthors = Nguyen AW, Daugherty PS | title = इंट्रासेल्युलर FRET के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का विकासवादी अनुकूलन| journal = Nature Biotechnology | volume = 23 | issue = 3 | pages = 355–60 | date = March 2005 | pmid = 15696158 | doi = 10.1038/nbt1066 | s2cid = 24202205 }}</ref> या इमल्शन बूंदें में विभाजित करते है।<ref>{{cite journal | vauthors = Schaerli Y, Hollfelder F | title = प्रायोगिक जीव विज्ञान में तेल में माइक्रोफ्लुइडिक जल-बूंदों की क्षमता| journal = Molecular BioSystems | volume = 5 | issue = 12 | pages = 1392–404 | date = December 2009 | pmid = 20023716 | doi = 10.1039/b907578j }}</ref> और फिर पृथक किए गए जीन अनुक्रमों को पीसीआर या रूपांतरित होस्ट बैक्टीरिया द्वारा बढ़ाया जाता है। या तो एकल सर्वश्रेष्ठ अनुक्रम, या अनुक्रमों का पूल उत्परिवर्तन के अगले वृत्त शैल के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है। विविधीकरण-चयन-प्रवर्धन के दोहराए गए चक्र प्रयुक्त चयन दबावों के अनुकूल प्रोटीन वेरिएंट उत्पन्न करते हैं। | ||
==तर्कसंगत प्रोटीन डिजाइन की तुलना== | ==तर्कसंगत प्रोटीन डिजाइन की तुलना== | ||
===निर्देशित विकास के लाभ=== | ===निर्देशित विकास के लाभ=== | ||
प्रोटीन का [[प्रोटीन डिज़ाइन]] [[प्रोटीन संरचना]], साथ ही इसके [[उत्प्रेरक तंत्र]] के गहन ज्ञान पर निर्भर करता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Marshall SA, Lazar GA, Chirino AJ, Desjarlais JR | title = चिकित्सीय प्रोटीन का तर्कसंगत डिजाइन और इंजीनियरिंग| journal = Drug Discovery Today | volume = 8 | issue = 5 | pages = 212–21 | date = March 2003 | pmid = 12634013 | doi = 10.1016/s1359-6446(03)02610-2 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Wilson CJ | title = Rational protein design: developing next-generation biological therapeutics and nanobiotechnological tools | journal = Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology | volume = 7 | issue = 3 | pages = 330–41 | date = 27 October 2014 | pmid = 25348497 | doi = 10.1002/wnan.1310 }}</ref> | प्रोटीन का [[प्रोटीन डिज़ाइन]] [[प्रोटीन संरचना]], साथ ही इसके [[उत्प्रेरक तंत्र]] के गहन ज्ञान पर निर्भर करता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Marshall SA, Lazar GA, Chirino AJ, Desjarlais JR | title = चिकित्सीय प्रोटीन का तर्कसंगत डिजाइन और इंजीनियरिंग| journal = Drug Discovery Today | volume = 8 | issue = 5 | pages = 212–21 | date = March 2003 | pmid = 12634013 | doi = 10.1016/s1359-6446(03)02610-2 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Wilson CJ | title = Rational protein design: developing next-generation biological therapeutics and nanobiotechnological tools | journal = Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology | volume = 7 | issue = 3 | pages = 330–41 | date = 27 October 2014 | pmid = 25348497 | doi = 10.1002/wnan.1310 }}</ref> पुनः प्रोटीन के कार्य को परिवर्तन ने के प्रयास में [[साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन]] द्वारा विशिष्ट परिवर्तन किए जाते हैं। इसका दोष यह है कि तथापि प्रोटीन की संरचना और क्रिया का तंत्र सही प्रकार से ज्ञात हो, फिर भी उत्परिवर्तन के कारण होने वाले परिवर्तन की भविष्यवाणी करना कठिन है। इसलिए, डीई का लाभ यह है कि वांछित गतिविधि के तंत्र को समझने की आवश्यकता नहीं है या उत्परिवर्तन इसे कैसे प्रभावित करते है।<ref name="ReferenceB">{{cite journal | vauthors = Giger L, Caner S, Obexer R, Kast P, Baker D, Ban N, Hilvert D | title = डिज़ाइन किए गए रेट्रो-एल्डोलेज़ के विकास से पूर्ण सक्रिय साइट रीमॉडलिंग होती है| journal = Nature Chemical Biology | volume = 9 | issue = 8 | pages = 494–8 | date = August 2013 | pmid = 23748672 | pmc = 3720730 | doi = 10.1038/nchembio.1276 }}</ref> | ||
===निर्देशित विकास की सीमाएँ=== | ===निर्देशित विकास की सीमाएँ=== | ||
निर्देशित विकास का प्रतिबंध यह है कि | निर्देशित विकास का प्रतिबंध यह है कि उच्च संख्या में विभिन्न यादृच्छिक उत्परिवर्तनों के प्रभावों को मापने के लिए उच्च-थ्रूपुट परख की आवश्यकता होती है। निर्देशित विकास के लिए उपयोग किए जाने से पहले इसके लिए व्यापक अनुसंधान और विकास की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, ऐसे परीक्षण प्रायः किसी विशेष गतिविधि की निगरानी के लिए अत्यधिक विशिष्ट होते हैं और इसलिए इन्हें नए डीई प्रयोगों में स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Bornscheuer UT, Pohl M | title = निर्देशित विकास और तर्कसंगत प्रोटीन डिजाइन द्वारा बेहतर जैव उत्प्रेरक| journal = Current Opinion in Chemical Biology | volume = 5 | issue = 2 | pages = 137–43 | date = April 2001 | pmid = 11282339 | doi = 10.1016/s1367-5931(00)00182-4 }}</ref> | ||
इसके अतिरिक्त, परख कार्य में सुधार के लिए चयन करने से परख कार्य में सुधार उत्पन्न होता है। यह समझने के लिए कि ये सुधार कैसे प्राप्त किए जाते हैं, विकसित हो रहे एंजाइम के गुणों को मापना | इसके अतिरिक्त, परख कार्य में सुधार के लिए चयन करने से परख कार्य में सुधार उत्पन्न होता है। यह समझने के लिए कि ये सुधार कैसे प्राप्त किए जाते हैं, विकसित हो रहे एंजाइम के गुणों को मापना होता है। और परख गतिविधि में सुधार एंजाइम उत्प्रेरक गतिविधि या एंजाइम एकाग्रता में सुधार के कारण हो सकता है। इस तथ्य का भी कोई प्रमाण नहीं है कि सब्सट्रेट पर सुधार से दूसरे सब्सट्रेट पर गतिविधि में सुधार होगा। यह विशेष रूप से तब महत्वपूर्ण होता है जब वांछित गतिविधि की सीधे जांच या चयन नहीं किया जा सकता है और इसलिए 'प्रॉक्सी' सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है। वांछित गतिविधि में सुधार किए बिना डीई प्रॉक्सी को विकासवादी विशेषज्ञता प्रदान कर सकता है। अतः परिणामस्वरुप, सफल डीई के लिए उचित स्क्रीनिंग या चयन नियम का चयन करना महत्वपूर्ण है।<ref>{{Cite book|title=Directed enzyme evolution: screening and selection methods|last1=Arnold|first1=Frances|last2=Georgiou|first2=George|date=2003|publisher=Humana Press|isbn=9781588292865|location=Totowa, N.J.|oclc=52400248}}</ref> | ||
किसी प्रयोग में विकास की गति भी निर्देशित विकास की उपयोगिता पर सीमा उत्पन्न करती है। उदाहरण के लिए, किसी विशेष फेनोटाइप का विकास सैद्धांतिक रूप से संभव होते हुए भी समय- | किसी प्रयोग में विकास की गति भी निर्देशित विकास की उपयोगिता पर सीमा उत्पन्न करती है। उदाहरण के लिए, किसी विशेष फेनोटाइप का विकास सैद्धांतिक रूप से संभव होते हुए भी समय-माप पर हो सकता है जो व्यावहारिक रूप से संभव नहीं है।<ref>{{Cite journal|last=Kaznatcheev|first=Artem|date=2019-05-01|title=विकास पर अंतिम बाधा के रूप में कम्प्यूटेशनल जटिलता|journal=Genetics|language=en|volume=212|issue=1|pages=245–265|doi=10.1534/genetics.119.302000|issn=0016-6731|pmid=30833289|pmc=6499524|doi-access=free}}</ref> वर्तमान के सैद्धांतिक दृष्टिकोणों का उद्देश्य सांख्यिकीय भौतिकी से एडियाबेटिकिटी काउंटर-डायबिटिक ड्राइविंग तकनीकों के शॉर्टकट के अनुप्रयोग के माध्यम से गति की सीमा को दूर करना है, चूंकि इसे अभी तक निर्देशित विकास प्रयोग में प्रयुक्त नहीं किया गया है।<ref>{{Cite journal|last1=Iram|first1=Shamreen|last2=Dolson|first2=Emily|last3=Chiel|first3=Joshua|last4=Pelesko|first4=Julia|last5=Krishnan|first5=Nikhil|last6=Güngör|first6=Özenç|last7=Kuznets-Speck|first7=Benjamin|last8=Deffner|first8=Sebastian|last9=Ilker|first9=Efe|last10=Scott|first10=Jacob G.|last11=Hinczewski|first11=Michael|date=2020-08-24|title=काउंटरडायबिटिक ड्राइविंग के साथ विकास की गति और प्रक्षेप पथ को नियंत्रित करना|url=https://www.nature.com/articles/s41567-020-0989-3|journal=Nature Physics|volume=17|language=en|pages=135–142|doi=10.1038/s41567-020-0989-3|issn=1745-2481|arxiv=1912.03764|s2cid=224474363}}</ref> | ||
===संयुक्त दृष्टिकोण=== | ===संयुक्त दृष्टिकोण=== | ||
तर्कसंगत डिजाइन और निर्देशित विकास दोनों की सीमाओं को संबोधित करने के लिए संयुक्त, 'अर्ध-तर्कसंगत' दृष्टिकोण की जांच की जा रही है।<ref name="ReferenceA"/><ref name="Goldsmith M 2012">{{cite journal | vauthors = Goldsmith M, Tawfik DS | title = Directed enzyme evolution: beyond the low-hanging fruit | journal = Current Opinion in Structural Biology | volume = 22 | issue = 4 | pages = 406–12 | date = August 2012 | pmid = 22579412 | doi = 10.1016/j.sbi.2012.03.010 }}</ref> लाभकारी उत्परिवर्तन दुर्लभ हैं, इसलिए | तर्कसंगत डिजाइन और निर्देशित विकास दोनों की सीमाओं को संबोधित करने के लिए संयुक्त, 'अर्ध-तर्कसंगत' दृष्टिकोण की जांच की जा रही है।<ref name="ReferenceA"/><ref name="Goldsmith M 2012">{{cite journal | vauthors = Goldsmith M, Tawfik DS | title = Directed enzyme evolution: beyond the low-hanging fruit | journal = Current Opinion in Structural Biology | volume = 22 | issue = 4 | pages = 406–12 | date = August 2012 | pmid = 22579412 | doi = 10.1016/j.sbi.2012.03.010 }}</ref> लाभकारी उत्परिवर्तन दुर्लभ हैं, इसलिए उत्तम वेरिएंट खोजने के लिए उच्च संख्या में यादृच्छिक म्यूटेंट की जांच करनी होती है। 'केंद्रित लाइब्रेरी' डीई के उत्परिवर्तन चरण के लिए लाभकारी उत्परिवर्तन में समृद्ध माने जाने वाले यादृच्छिक क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। केंद्रित लाइब्रेरी में पारंपरिक यादृच्छिक उत्परिवर्तन लाइब्रेरी की तुलना में कम वेरिएंट होते हैं और इसलिए ऐसी उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की आवश्यकता नहीं होती है। | ||
एक केंद्रित लाइब्रेरी बनाने के लिए कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती है कि संरचना में किन अवशेषों को | एक केंद्रित लाइब्रेरी बनाने के लिए कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती है कि संरचना में किन अवशेषों को परिवर्तन ना है। इस प्रकार से उदाहरण के लिए, किसी एंजाइम की [[सक्रिय साइट]] का ज्ञान [[एंजाइम सब्सट्रेट (जीव विज्ञान)]] के साथ वार्तालाप करने के लिए ज्ञात अवशेषों को यादृच्छिक बनाने की अनुमति दे सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Chen MM, Snow CD, Vizcarra CL, Mayo SL, Arnold FH | title = Comparison of random mutagenesis and semi-rational designed libraries for improved cytochrome P450 BM3-catalyzed hydroxylation of small alkanes | journal = Protein Engineering, Design & Selection | volume = 25 | issue = 4 | pages = 171–8 | date = April 2012 | pmid = 22334757 | doi = 10.1093/protein/gzs004 | doi-access = free }}</ref><ref>{{cite book | vauthors = Acevedo-Rocha CG, Hoebenreich S, Reetz MT | title = निर्देशित विकास पुस्तकालय निर्माण| chapter = Iterative saturation mutagenesis: a powerful approach to engineer proteins by systematically simulating Darwinian evolution | series = Methods in Molecular Biology | volume = 1179 | pages = 103–28 | date = 2014 | pmid = 25055773 | doi = 10.1007/978-1-4939-1053-3_7 | isbn = 978-1-4939-1052-6 }}</ref> वैकल्पिक रूप से, प्रकृति में कौन से प्रोटीन क्षेत्र पृथक्करण स्थल हैं, इसका ज्ञान केवल उन क्षेत्रों में उत्परिवर्तन का मार्गदर्शन कर सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Jochens H, Bornscheuer UT | title = केंद्रित निर्देशित विकास को निर्देशित करने के लिए प्राकृतिक विविधता| journal = ChemBioChem | volume = 11 | issue = 13 | pages = 1861–6 | date = September 2010 | pmid = 20680978 | doi = 10.1002/cbic.201000284 | s2cid = 28333030 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Jochens H, Aerts D, Bornscheuer UT | title = संरेखण-निर्देशित केंद्रित निर्देशित विकास द्वारा एस्टरेज़ का थर्मोस्टैबिलाइज़ेशन| journal = Protein Engineering, Design & Selection | volume = 23 | issue = 12 | pages = 903–9 | date = December 2010 | pmid = 20947674 | doi = 10.1093/protein/gzq071 | doi-access = free }}</ref> | ||
==अनुप्रयोग== | ==अनुप्रयोग== | ||
तर्कसंगत डिजाइन के विकल्प के रूप में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए | इस प्रकार से तर्कसंगत डिजाइन के विकल्प के रूप में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए प्रायः निर्देशित विकास का उपयोग किया जाता है,<ref name="ReferenceC">{{cite journal | vauthors = Turner NJ | title = निर्देशित विकास जैव उत्प्रेरकों की अगली पीढ़ी को संचालित करता है| journal = Nature Chemical Biology | volume = 5 | issue = 8 | pages = 567–73 | date = August 2009 | pmid = 19620998 | doi = 10.1038/nchembio.203 }}</ref> किन्तु इसका उपयोग एंजाइम विकास के मूलभूत प्रश्नों की जांच के लिए भी किया जा सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Romero PA, Arnold FH | title = निर्देशित विकास द्वारा प्रोटीन फिटनेस परिदृश्य की खोज| journal = Nature Reviews. Molecular Cell Biology | volume = 10 | issue = 12 | pages = 866–76 | date = December 2009 | pmid = 19935669 | pmc = 2997618 | doi = 10.1038/nrm2805 }}</ref> | ||
===प्रोटीन इंजीनियरिंग=== | ===प्रोटीन इंजीनियरिंग=== | ||
प्रोटीन इंजीनियरिंग उपकरण के रूप में, | प्रोटीन इंजीनियरिंग उपकरण के रूप में, डीई तीन क्षेत्रों में अधिक सफल रहा है: | ||
# उच्च तापमान या कठोर सॉल्वैंट्स में जैव प्रौद्योगिकी उपयोग के लिए [[प्रोटीन स्थिरता]] में सुधार<ref>{{cite journal | vauthors = Gatti-Lafranconi P, Natalello A, Rehm S, Doglia SM, Pleiss J, Lotti M | title = शीत-सक्रिय एंजाइम में स्थिरता का विकास विशिष्ट छूट प्राप्त करता है और तापमान अनुकूलन पर सब्सट्रेट-संबंधी प्रभावों को उजागर करता है| journal = Journal of Molecular Biology | volume = 395 | issue = 1 | pages = 155–66 | date = January 2010 | pmid = 19850050 | doi = 10.1016/j.jmb.2009.10.026 | url = https://figshare.com/articles/journal_contribution/1009214 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Zhao H, Arnold FH | title = निर्देशित विकास सबटिलिसिन ई को थर्मिटेज़ के कार्यात्मक समकक्ष में परिवर्तित करता है| journal = Protein Engineering | volume = 12 | issue = 1 | pages = 47–53 | date = January 1999 | pmid = 10065710 | doi = 10.1093/protein/12.1.47 | doi-access = free }}</ref><ref name="Favor_2020">{{cite journal | vauthors = Favor AH, Llanos CD, Youngblut MD, Bardales JA | title = त्वरित विकास मंच के माध्यम से बैक्टीरियोफेज इंजीनियरिंग का अनुकूलन| journal = Scientific Reports | volume = 10 | year = 2020 | issue = 1 | page = 13981 | pmid = 32814789 | pmc = 7438504 | doi = 10.1038/s41598-020-70841-1 }}</ref> | # उच्च तापमान या कठोर सॉल्वैंट्स में जैव प्रौद्योगिकी उपयोग के लिए [[प्रोटीन स्थिरता]] में सुधार<ref>{{cite journal | vauthors = Gatti-Lafranconi P, Natalello A, Rehm S, Doglia SM, Pleiss J, Lotti M | title = शीत-सक्रिय एंजाइम में स्थिरता का विकास विशिष्ट छूट प्राप्त करता है और तापमान अनुकूलन पर सब्सट्रेट-संबंधी प्रभावों को उजागर करता है| journal = Journal of Molecular Biology | volume = 395 | issue = 1 | pages = 155–66 | date = January 2010 | pmid = 19850050 | doi = 10.1016/j.jmb.2009.10.026 | url = https://figshare.com/articles/journal_contribution/1009214 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Zhao H, Arnold FH | title = निर्देशित विकास सबटिलिसिन ई को थर्मिटेज़ के कार्यात्मक समकक्ष में परिवर्तित करता है| journal = Protein Engineering | volume = 12 | issue = 1 | pages = 47–53 | date = January 1999 | pmid = 10065710 | doi = 10.1093/protein/12.1.47 | doi-access = free }}</ref><ref name="Favor_2020">{{cite journal | vauthors = Favor AH, Llanos CD, Youngblut MD, Bardales JA | title = त्वरित विकास मंच के माध्यम से बैक्टीरियोफेज इंजीनियरिंग का अनुकूलन| journal = Scientific Reports | volume = 10 | year = 2020 | issue = 1 | page = 13981 | pmid = 32814789 | pmc = 7438504 | doi = 10.1038/s41598-020-70841-1 }}</ref> | ||
# [[मोनोक्लोनल एंटीबॉडी थेरेपी]] की [[बंधनकारी आत्मीयता]] में सुधार (एफ़िनिटी परिपक्वता) | # [[मोनोक्लोनल एंटीबॉडी थेरेपी]] की [[बंधनकारी आत्मीयता|बाध्यकारी आत्मीयता]] में सुधार (एफ़िनिटी परिपक्वता)<ref>रेफरी>{{cite journal | vauthors = Hawkins RE, Russell SJ, Winter G | title = बाइंडिंग एफ़िनिटी द्वारा फ़ेज़ एंटीबॉडी का चयन। आत्मीयता परिपक्वता की नकल करना| journal = Journal of Molecular Biology | volume = 226 | issue = 3 | pages = 889–96 | date = August 1992 | pmid = 1507232 | doi = 10.1016/0022-2836(92)90639-2 }}</ref</ref> और डे नोवो प्रोटीन डिज़ाइन की गतिविधि<ref name="ReferenceB" /> या उपस्तिथ एंजाइमों की [[सब्सट्रेट विशिष्टता]] को परिवर्तन ना (प्रायः उद्योग में उपयोग के लिए) है,<ref>{{cite journal | vauthors = Shaikh FA, Withers SG | title = Teaching old enzymes new tricks: engineering and evolution of glycosidases and glycosyl transferases for improved glycoside synthesis | journal = Biochemistry and Cell Biology | volume = 86 | issue = 2 | pages = 169–77 | date = April 2008 | pmid = 18443630 | doi = 10.1139/o07-149 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Cheriyan M, Walters MJ, Kang BD, Anzaldi LL, Toone EJ, Fierke CA | title = एक लंबी श्रृंखला वाले एसाइल सब्सट्रेट को पहचानने के लिए पाइरूवेट एल्डोलेज़ का निर्देशित विकास| journal = Bioorganic & Medicinal Chemistry | volume = 19 | issue = 21 | pages = 6447–53 | date = November 2011 | pmid = 21944547 | pmc = 3209416 | doi = 10.1016/j.bmc.2011.08.056 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = MacBeath G, Kast P, Hilvert D | title = निर्देशित विकास द्वारा एंजाइम टोपोलॉजी को पुनः डिज़ाइन करना| journal = Science | volume = 279 | issue = 5358 | pages = 1958–61 | date = March 1998 | pmid = 9506949 | doi = 10.1126/science.279.5358.1958 | bibcode = 1998Sci...279.1958M }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Toscano MD, Woycechowsky KJ, Hilvert D | title = Minimalist active-site redesign: teaching old enzymes new tricks | journal = Angewandte Chemie | volume = 46 | issue = 18 | pages = 3212–36 | date = 2007 | pmid = 17450624 | doi = 10.1002/anie.200604205 }}</ref> <ref name="ReferenceC" /> | ||
रेफरी>{{cite journal | vauthors = Hawkins RE, Russell SJ, Winter G | title = बाइंडिंग एफ़िनिटी द्वारा फ़ेज़ एंटीबॉडी का चयन। आत्मीयता परिपक्वता की नकल करना| journal = Journal of Molecular Biology | volume = 226 | issue = 3 | pages = 889–96 | date = August 1992 | pmid = 1507232 | doi = 10.1016/0022-2836(92)90639-2 }}</ref> और डे नोवो प्रोटीन डिज़ाइन की गतिविधि<ref name="ReferenceB"/> | |||
===विकास अध्ययन=== | ===विकास अध्ययन=== | ||
{{see also| | {{see also|प्रायोगिक विकास}} | ||
प्राकृतिक विकास का अध्ययन परंपरागत रूप से उपस्तिथ जीवों और उनके जीन पर आधारित है। चूंकि, अनुसंधान मूल रूप से [[जीवाश्म]] की कमी (और विशेष रूप से [[प्राचीन डीएनए]] अनुक्रमों की कमी) के कारण सीमित है।<ref>{{cite journal | vauthors = Pääbo S, Poinar H, Serre D, Jaenicke-Despres V, Hebler J, Rohland N, Kuch M, Krause J, Vigilant L, Hofreiter M | title = प्राचीन डीएनए से आनुवंशिक विश्लेषण| journal = Annual Review of Genetics | volume = 38 | issue = 1 | pages = 645–79 | date = 2004 | pmid = 15568989 | doi = 10.1146/annurev.genet.37.110801.143214 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Höss M, Jaruga P, Zastawny TH, Dizdaroglu M, Pääbo S | title = डीएनए क्षति और प्राचीन ऊतकों से डीएनए अनुक्रम पुनर्प्राप्ति| journal = Nucleic Acids Research | volume = 24 | issue = 7 | pages = 1304–7 | date = April 1996 | pmid = 8614634 | pmc = 145783 | doi = 10.1093/nar/24.7.1304 }}</ref> और प्राचीन पर्यावरणीय परिस्थितियों का अधूरा ज्ञान है। अतः निर्देशित विकास व्यक्तिगत [[एंजाइमों]] के लिए जीन की नियंत्रित प्रणाली में विकास की जांच करता है,<ref>{{cite journal | vauthors = Bloom JD, Arnold FH | title = In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution | journal = Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | volume = 106 Suppl 1 | issue = Supplement_1 | pages = 9995–10000 | date = June 2009 | pmid = 19528653 | pmc = 2702793 | doi = 10.1073/pnas.0901522106 | doi-access = free }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Moses AM, Davidson AR | title = इन विट्रो विकास गहराई तक जाता है| journal = Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | volume = 108 | issue = 20 | pages = 8071–2 | date = May 2011 | pmid = 21551096 | pmc = 3100951 | doi = 10.1073/pnas.1104843108 | bibcode = 2011PNAS..108.8071M | doi-access = free }}</ref><ref name="Goldsmith M 2012"/> [[राइबोजाइम]]<ref>{{cite journal | vauthors = Salehi-Ashtiani K, Szostak JW | title = इन विट्रो विकास में हैमरहेड राइबोजाइम के लिए कई उत्पत्ति का सुझाव दिया गया है| journal = Nature | volume = 414 | issue = 6859 | pages = 82–4 | date = November 2001 | pmid = 11689947 | doi = 10.1038/35102081 | bibcode = 2001Natur.414...82S | s2cid = 4401483 }}</ref> और [[रेप्लिकेटर (विकास इकाई)|प्रतिकृतियां (विकास इकाई)]]<ref>{{cite journal | vauthors = Sumper M, Luce R | title = बैक्टीरियोफेज क्यूबेटा प्रतिकृति द्वारा स्व-प्रतिकृति और पर्यावरण की दृष्टि से अनुकूलित आरएनए संरचनाओं के नए उत्पादन के लिए साक्ष्य| journal = Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | volume = 72 | issue = 1 | pages = 162–6 | date = January 1975 | pmid = 1054493 | pmc = 432262 | doi = 10.1073/pnas.72.1.162 | bibcode = 1975PNAS...72..162S | doi-access = free }}</ref><ref name="An extracellular Darwinian experime"/> ([[ यूकैर्योसाइटों | यूकेरियोट्स]] के प्रायोगिक विकास के समान,<ref>{{cite journal | vauthors = Marden JH, Wolf MR, Weber KE | title = हवा की दिशा में उड़ान भरने की क्षमता के लिए चुनी गई आबादी से ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का हवाई प्रदर्शन| journal = The Journal of Experimental Biology | volume = 200 | issue = Pt 21 | pages = 2747–55 | date = November 1997 | doi = 10.1242/jeb.200.21.2747 | pmid = 9418031 }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Ratcliff WC, Denison RF, Borrello M, Travisano M|author4-link= Michael Travisano | title = बहुकोशिकीयता का प्रायोगिक विकास| journal = Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | volume = 109 | issue = 5 | pages = 1595–600 | date = January 2012 | pmid = 22307617 | pmc = 3277146 | doi = 10.1073/pnas.1115323109 | bibcode = 2012PNAS..109.1595R | doi-access = free }}</ref> [[प्रोकैर्योसाइटों]]<ref>{{cite journal | vauthors = Barrick JE, Yu DS, Yoon SH, Jeong H, Oh TK, Schneider D, Lenski RE, Kim JF | title = एस्चेरिचिया कोलाई के साथ दीर्घकालिक प्रयोग में जीनोम विकास और अनुकूलन| journal = Nature | volume = 461 | issue = 7268 | pages = 1243–7 | date = October 2009 | pmid = 19838166 | doi = 10.1038/nature08480 | bibcode = 2009Natur.461.1243B | s2cid = 4330305 }}</ref> और [[वायरस]]<ref>{{cite journal | vauthors = Heineman RH, Molineux IJ, Bull JJ | title = Evolutionary robustness of an optimal phenotype: re-evolution of lysis in a bacteriophage deleted for its lysin gene | journal = Journal of Molecular Evolution | volume = 61 | issue = 2 | pages = 181–91 | date = August 2005 | pmid = 16096681 | doi = 10.1007/s00239-004-0304-4 | bibcode = 2005JMolE..61..181H | s2cid = 31230414 }}</ref>) है. | |||
अतः डीई चयन दबाव, [[उत्परिवर्तन दर]] और [[पर्यावरण (जैवभौतिकीय)]] (दोनों [[अजैविक घटक]] जैसे तापमान, और जैविक वातावरण, जैसे जीव में अन्य जीन) के नियंत्रण की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, सभी विकासवादी मध्यवर्ती जीनों का पूर्ण रिकॉर्ड है। यह विकासवादी प्रक्रियाओं के विस्तृत माप की अनुमति देता है, इस प्रकार से उदाहरण के लिए [[एपिस्टासिस]], [[विकासात्मकता]], अनुकूलनवाद या आनुवंशिक बाधाएं<ref>{{cite journal | vauthors = Steinberg B, Ostermeier M | title = पर्यावरणीय परिवर्तन विकासवादी घाटियों को पाटते हैं| journal = Science Advances | volume = 2 | issue = 1 | pages = e1500921 | date = January 2016 | pmid = 26844293 | pmc = 4737206 | doi = 10.1126/sciadv.1500921 | bibcode = 2016SciA....2E0921S }}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Arnold FH, Wintrode PL, Miyazaki K, Gershenson A | title = How enzymes adapt: lessons from directed evolution | journal = Trends in Biochemical Sciences | volume = 26 | issue = 2 | pages = 100–6 | date = February 2001 | pmid = 11166567 | doi = 10.1016/s0968-0004(00)01755-2 | s2cid = 13331137 }}</ref> [[फिटनेस परिदृश्य]],<ref>{{cite journal | vauthors = Aita T, Hamamatsu N, Nomiya Y, Uchiyama H, Shibanaka Y, Husimi Y | title = निर्देशित विकास के अध्ययन के लिए एपिस्टैटिक साइटों के साथ एक प्रोटीन के स्थानीय फिटनेस परिदृश्य का सर्वेक्षण करना| journal = Biopolymers | volume = 64 | issue = 2 | pages = 95–105 | date = July 2002 | pmid = 11979520 | doi = 10.1002/bip.10126 }}</ref> और [[तटस्थ नेटवर्क]] है।<ref>{{cite journal | vauthors = Bloom JD, Raval A, Wilke CO | title = तटस्थ प्रोटीन विकास की ऊष्मप्रवैगिकी| journal = Genetics | volume = 175 | issue = 1 | pages = 255–66 | date = January 2007 | pmid = 17110496 | pmc = 1775007 | arxiv=q-bio/0605041 |doi = 10.1534/genetics.106.061754 }}</ref> | |||
=== माइक्रोबियल [[प्रोटीओम]] का अनुकूली प्रयोगशाला विकास === | === माइक्रोबियल [[प्रोटीओम]] का अनुकूली प्रयोगशाला विकास === | ||
प्रोटिओम की प्राकृतिक अमीनो एसिड संरचना को प्रयोगात्मक रूप से लगाए गए [[चयनात्मक दबाव]] के | प्रोटिओम की प्राकृतिक अमीनो एसिड संरचना को प्रयोगात्मक रूप से लगाए गए [[चयनात्मक दबाव]] के अधीन उपयुक्त गैर-विहित समकक्षों के साथ वैश्विक विहित अमीनो एसिड प्रतिस्थापन द्वारा परिवर्तन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एस्चेरिचिया कोलाई में फ्लोरिनेटेड एनालॉग्स के साथ प्राकृतिक अमीनो एसिड के वैश्विक प्रोटीन-व्यापक प्रतिस्थापन का प्रयास किया गया है।<ref>{{cite journal | ||
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विकास की तुलना में निर्देशित विकास का उदाहरण। आंतरिक चक्र कोष्ठक में प्राकृतिक प्रक्रिया की अनुकरण के साथ निर्देशित विकास चक्र के 3 चरणों को इंगित करता है। बाहरी वृत्त विशिष्ट प्रयोग के चरणों को दर्शाता है। लाल प्रतीक कार्यात्मक वेरिएंट को दर्शाते हैं, पीले प्रतीक कम फ़ंक्शन वाले वेरिएंट को दर्शाते हैं।
निर्देशित विकास (डीई) प्रोटीन इंजीनियरिंग में उपयोग की जाने वाली विधि है जो की उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित लक्ष्य की ओर प्रोटीन या न्यूक्लिक अम्ल को चलाने के लिए प्राकृतिक चयन की प्रक्रिया की अनुकरण करती है।[1] इसमें जीन को उत्परिवर्तन के पुनरावृत्त वृत्त शैल (वेरिएंट की लाइब्रेरी बनाना), चयन (उन वेरिएंट को व्यक्त करना और वांछित फ़ंक्शन के साथ सदस्यों को अलग करना) और प्रवर्धन (अगले वृत्त शैल के लिए टेम्पलेट तैयार करना) के अधीन करना सम्मिलत है। इसे विवो (जीवित जीवों में), या कृत्रिम परिवेशीय (कोशिकाओं में या मुक्त समाधान में) किया जा सकता है। निर्देशित विकास का उपयोग प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए तर्कसंगत डिजाइन संशोधित प्रोटीन के विकल्प के रूप में, साथ ही नियंत्रित, प्रयोगशाला वातावरण में मौलिक विकास के प्रयोगात्मक विकास अध्ययन के लिए किया जाता है।
इतिहास
इस प्रकार से निर्देशित विकास की उत्पत्ति 1960 के दशक में हुई थी।[2] अतः "स्पीगेलमैन्स मॉन्स्टर" प्रयोग में आरएनए के विकास के साथ किया है।[3] इस अवधारणा को चयन दबाव के अधीन बैक्टीरिया के विकास के माध्यम से प्रोटीन विकास तक बढ़ाया गया था जो इसके जीनोम में एकल जीन के विकास का पक्षधर था।[4]
किन्तु1980 के दशक में प्रारंभिक चरण प्रदर्शन तकनीकों ने एकल प्रोटीन में उत्परिवर्तन और चयन को लक्षित करने की अनुमति दी थी।[5] इसने उन्नत बाध्यकारी प्रोटीन के चयन को सक्षम किया, किन्तु एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि के चयन के साथ अभी तक संगत नहीं था।[6] एंजाइमों को विकसित करने के विधि 1990 के दशक में विकसित किए गए और इस तकनीक को व्यापक वैज्ञानिक दर्शकों तक पहुंचाया गया था।[7] जीन वेरिएंट की लाइब्रेरी बनाने और उनकी गतिविधि की स्क्रीनिंग के लिए नए विधियो के साथ क्षेत्र का तीव्रता से विस्तार हुआ था।[2][8] निर्देशित विकास विधियों के विकास को 2018 में एंजाइमों के विकास के लिए फ्रांसिस अर्नोल्ड और फेज प्रदर्शन के लिए जॉर्ज स्मिथ (रसायनज्ञ) और ग्रेगरी विंटर को रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार देकर सम्मानित किया गया था।[9]
सिद्धांत
File:DE landscape.png
निर्देशित विकास 'फिटनेस परिदृश्य' पर पहाड़ी पर चढ़ने के समान है जहां ऊंचाई वांछित संपत्ति का प्रतिनिधित्व करती है। चयन का प्रत्येक वृत्त शैल प्रारंभ टेम्पलेट (1) के सभी किनारों पर उत्परिवर्ती का नमूना लेता है और उच्चतम ऊंचाई वाले उत्परिवर्ती का चयन करता है, जिससे पहाड़ी पर चढ़ जाता है। इसे तब तक दोहराया जाता है जब तक कि स्थानीय शिखर तक नहीं पहुंच जाता (2) है।
निर्देशित विकास प्रयोगशाला स्थापना में प्राकृतिक विकास चक्र की अनुकरण है। विकास के लिए तीन चीजों की आवश्यकता होती है: प्रतिकृतियों के मध्य आनुवंशिक विविधता, यह भिन्नता फिटनेस (जीव विज्ञान) का कारण बनती है जिस पर चयन कार्य करता है, और यह भिन्नता आनुवंशिकता है। डीई में, एकल जीन उत्परिवर्तन, चयन या स्क्रीनिंग और प्रवर्धन के पुनरावृत्त वृत्त शैल द्वारा विकसित होता है।[10] इन चरणों के राउंड सामान्यतः दोहराए जाते हैं, चरणबद्ध सुधार प्राप्त करने के लिए अगले राउंड के लिए टेम्पलेट के रूप में राउंड से सर्वोत्तम संस्करण का उपयोग किया जाता है।
एक निर्देशित विकास प्रयोग में सफलता की संभावना सीधे कुल लाइब्रेरी आकार से संबंधित है, क्योंकि अधिक म्यूटेंट का मूल्यांकन करने से वांछित गुणों के साथ को खोजने की संभावना बढ़ जाती है।[11]
विभिन्नता उत्पन्न करना
प्रारंभिक जीन (बाएं) और वेरिएंट की लाइब्रेरी (दाएं)। बिंदु उत्परिवर्तन एकल न्यूक्लियोटाइड को परिवर्तन ते हैं। डीएनए के अनुभागों को जोड़ें या हटाएं। आनुवंशिक पुनर्संयोजन दो (या अधिक) समान जीनों के खंडों को पुनः संयोजित करता है।
अतः फ़ाइल: कैसे यादृच्छिक डीएनए लाइब्रेरी नमूना अनुक्रम स्थान.पीडीएफ अंगूठा कैसे लाइब्रेरी (जीव विज्ञान) उत्परिवर्तन (आणविक जीव विज्ञान तकनीक) द्वारा उत्पन्न होता है या रैंडम उत्परिवर्तन नमूना अनुक्रम स्थान है। किसी दिए गए स्थान पर प्रतिस्थापित अमीनो एसिड दिखाया गया है। प्रत्येक बिंदु या जुड़े बिंदुओं का सेट लाइब्रेरी का सदस्य है। त्रुटि-प्रवण पीसीआर यादृच्छिक रूप से कुछ अवशेषों को अन्य अमीनो एसिड में परिवर्तन कर देता है। एलेनिन स्कैनिंग प्रोटीन के प्रत्येक अवशेष को एक-एक करके एलेनिन से परिवर्तन देती है। अतः साइट संतृप्ति 20 संभावित अमीनो एसिड (या उनमें से कुछ उपसमूह) में से प्रत्येक को एक-एक करके ही स्थान पर प्रतिस्थापित करती है।
निर्देशित विकास के चक्र को निष्पादित करने में प्रथम चरण भिन्न जीनों की लाइब्रेरी का निर्माण है। यादृच्छिक अनुक्रम के लिए अनुक्रम स्थान विशाल है(100 अमीनो एसिड प्रोटीन के लिए 10130 संभावित अनुक्रम) और कार्यात्मक प्रोटीन द्वारा अधिक कम जनसँख्या है। न तो प्रयोगात्मक,[12] न ही प्राकृतिक[13] विकास कभी भी इतने सारे अनुक्रमों का नमूना लेने के समीप पहुंच सकता है। बेशक, प्राकृतिक विकास नमूने कार्यात्मक प्रोटीन अनुक्रमों के समीप भिन्न अनुक्रमों का नमूना लेते हैं और पहले से ही कार्यात्मक जीन को उत्परिवर्तित करके डीई में इसका अनुकरण किया जाता है।
इस प्रकार से कुछ गणनाओं से पता चलता है कि यह पूर्ण रूप से संभव है कि सभी व्यावहारिक (अर्थात कार्यात्मक और संरचनात्मक) उद्देश्यों के लिए, पृथ्वी पर जीवन के विकास के समय प्रोटीन अनुक्रम स्थान का पूर्ण रूप से पता लगाया गया है।[13]
और प्रारंभिक जीन को यादृच्छिक बिंदु उत्परिवर्तन (रासायनिक उत्परिवर्तन या त्रुटि प्रवण पॉलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा) उत्परिवर्तित किया जा सकता है।[14][15] और इंडेल (ट्रांसपोज़न द्वारा)।[16] डीएनए परिवर्तन द्वारा आनुवंशिक पुनर्संयोजन की अनुकरण की जा सकती है[17][18] परिवर्तन किए गए मूल जीनों के मध्य अनुक्रम स्थान के क्षेत्रों में सम्मिलित करने के लिए अनेक अनुक्रमों (सामान्यतः 70% से अधिक अनुक्रम पहचान) की है। अंत में, जीन के विशिष्ट क्षेत्रों को व्यवस्थित रूप से यादृच्छिक संरचना और कार्य ज्ञान पर आधारित अधिक केंद्रित दृष्टिकोण के लिए किया जा सकता है।[19] किन्तु विधि के आधार पर, उत्पन्न लाइब्रेरी इसमें सम्मिलत फिटनेस प्रभावों के वितरण में भिन्न होती है। तथापि किसी जीव का उपयोग रुचि के जीन को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, केवल उस जीन को उत्परिवर्तित करने से जीव का बाकी जीनोम वही रहता है और विकास प्रयोग के लिए इसे अनदेखा किया जा सकता है (एक निरंतर आनुवंशिक वातावरण प्रदान करने की सीमा तक) है।
फिटनेस अंतर का पता लगाना
अधिकांश उत्परिवर्तन हानिकारक होते हैं और इसलिए उत्परिवर्ती लाइब्रेरीों में अधिकतर कम उत्प्रेरक गतिविधि वाले वेरिएंट होते हैं।[20] इसलिए, वांछित गुणों में सुधार करने वाले लाभकारी उत्परिवर्तन वाले दुर्लभ वेरिएंट को खोजने के लिए गतिविधि को मापने के लिए उच्च-थ्रूपुट परख महत्वपूर्ण है। कार्यात्मक वेरिएंट को अलग करने के लिए विधि की दो मुख्य श्रेणियां उपस्तिथ हैं। चयन प्रणालियाँ जीन के जीवित रहने के लिए प्रोटीन फ़ंक्शन को सीधे जोड़ती हैं, जबकि स्क्रीनिंग प्रणाली व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्रकार की परख करते हैं और वांछित गतिविधि के प्रकार या विभिन्न प्रकार की जनसँख्या को सॉर्ट करने के लिए मात्रात्मक सीमा निर्धारित करने की अनुमति देते हैं। अर्थात चयन और स्क्रीनिंग दोनों को जीवित कोशिकाओं (इन विवो इवोल्यूशन) में किया जा सकता है या बिना किसी कोशिका के सीधे प्रोटीन या आरएनए पर (इन विट्रो इवोल्यूशन) किया जा सकता है।[21][22]
इस प्रकार से विवो विकास के समय, प्रत्येक कोशिका (सामान्यतः जीवाणु या ख़मीर ) प्लाज्मिड के साथ परिवर्तन (आनुवांशिकी) होती है जिसमें वेरिएंट लाइब्रेरी का अलग सदस्य होता है। इस प्रकार, कोशिकाओं के मध्य केवल रुचि का जीन ही भिन्न होता है, अन्य सभी जीनों को समान रखा जाता है। और कोशिकाएं प्रोटीन को या तो अपने कोशिका द्रव्य या प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त करती हैं जहां इसके कार्य का परीक्षण किया जा सकता है। इस प्रारूप में सेलुलर वातावरण में गुणों का चयन करने का लाभ होता है, जो तब उपयोगी होता है जब विकसित प्रोटीन या आरएनए का उपयोग जीवित जीवों में किया जाना होता है। जब कोशिकाओं के बिना प्रदर्शन किया जाता है, तो डीई में समाधान में प्रोटीन या आरएनए मुक्त उत्पादन करने या इन विट्रो कंपार्टमेंटलाइज़ेशन में विभाजित करने के लिए इन विट्रो कंपार्टमेंटलाइज़ेशन या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन. 2एफ अनुवाद का उपयोग सम्मिलत होता है। इस विधि में चयन स्थितियों (जैसे तापमान, विलायक) में अधिक बहुमुखी होने का लाभ है, और यह प्रोटीन व्यक्त कर सकता है जो की कोशिकाओं के लिए विषाक्त होती है। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो विकास प्रयोग कहीं अधिक उच्च लाइब्रेरी (1015 तक) उत्पन्न कर सकते हैं) क्योंकि लाइब्रेरी डीएनए को कोशिकाओं में परिवर्तन (आनुवांशिकी) की आवश्यकता नहीं होती है ((प्रायः एक सीमित चरण) है।
चयन
प्रोबूजेन गतिविधि के लिए चयन अवधारणात्मक रूप से सरल है। किन्तु लक्ष्य अणु को ठोस समर्थन पर स्थिर किया जाता है, विभिन्न प्रोटीनों की लाइब्रेरी को इसके ऊपर प्रवाहित किया जाता है, व्यर्थ बाइंडर्स को धोया जाता है, और शेष बंधे वेरिएंट को उनके जीन को अलग करने के लिए पुनर्प्राप्त किया जाता है।[23] सक्रिय उत्प्रेरक को अलग करने के प्रयास के रूप में एंजाइम को स्थिर सहसंयोजक एंजाइम अवरोधक से बांधने का भी उपयोग किया गया है। चूंकि, यह दृष्टिकोण केवल एकल उत्प्रेरक टर्नओवर के लिए चयन करता है और सब्सट्रेट बाइंडिंग या वास्तविक सब्सट्रेट प्रतिक्रियाशीलता का सही मॉडल नहीं है। यदि किसी महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट को संश्लेषित करके, या किसी विष को नष्ट करके, कोशिका अस्तित्व के लिए एंजाइम गतिविधि को आवश्यक बनाया जा सकता है, तो कोशिका अस्तित्व एंजाइम गतिविधि का कार्य है।[24][25] ऐसी प्रणालियाँ सामान्यतः केवल कोशिकाओं की परिवर्तन (आनुवांशिकी) दक्षता द्वारा थ्रूपुट में सीमित होती हैं। वे स्क्रीनिंग की तुलना में कम बहुमूल्य और श्रम-गहन भी हैं, चूंकि वे सामान्यतः इंजीनियर करने में कठिन होते हैं, और कलाकृतियों से ग्रस्त होते हैं और लाइब्रेरी में उपस्तिथ फिटनेस प्रभावों के वितरण के बारे में कोई जानकारी नहीं देते हैं।
स्क्रीनिंग
अतः चयन का विकल्प स्क्रीनिंग प्रणाली है। प्रत्येक प्रकार का जीन व्यक्तिगत रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैव प्रौद्योगिकी) है और गतिविधि को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए (प्रायः रंगीन या फ्लोरोजेनिक उत्पाद द्वारा) परखा जाता है। फिर वेरिएंट को रैंक किया जाता है और प्रयोगकर्ता निर्णय लेता है कि डीई के अगले वृत्त शैल के लिए कौन से वेरिएंट को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करना है। यहां तक कि अधिक उच्च थ्रूपुट परख में सामान्यतः चयन विधियों की तुलना में कम कवरेज होता है, किन्तु स्क्रीन किए गए प्रत्येक वेरिएंट पर विस्तृत जानकारी तैयार करने का लाभ मिलता है। इस अलग-अलग डेटा का उपयोग लाइब्रेरीों में गतिविधियों के वितरण को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है जो कि सरल चयन प्रणालियों में संभव नहीं है। इसलिए, जब अनुकूली विकास और फिटनेस परिदृश्यों को प्रयोगात्मक रूप से चित्रित करने का विचार आता है तो स्क्रीनिंग प्रणाली के लाभ होते हैं।
आनुवंशिकता सुनिश्चित करना
File:DE Linkage.png
एक व्यक्त प्रोटीन को या तो उसके जीन से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है (जैसे कि एमआरएनए, बाएं) या उसके साथ विभाजित किया जा सकता है (कोशिकाएं (जीव विज्ञान) या माइक्रोफ्लुइडिक्स, दाएं)। किसी भी तरह से यह सुनिश्चित होता है कि एन्कोडेड प्रोटीन की गतिविधि के आधार पर जीन को अलग किया जा सकता है।
जब कार्यात्मक प्रोटीन को अलग कर दिया गया है, तो यह आवश्यक है कि उनके जीन भी अलग हों, इसलिए आनुवंशिकता जीनोटाइप-फेनोटाइप लिंक की आवश्यकता होती है।[24] यह सहसंयोजक हो सकता है, जैसे कि एमआरएनए डिस्प्ले जहां एमआरएनए जीन पौरोमाइसिन द्वारा अनुवाद के अंत में प्रोटीन से जुड़ा होता है।[12] वैकल्पिक रूप से प्रोटीन और उसके जीन को जीवित कोशिकाओं में विभाजित करके सह-स्थानीयकृत किया जा सकता है[26] या इमल्शन बूंदें में विभाजित करते है।[27] और फिर पृथक किए गए जीन अनुक्रमों को पीसीआर या रूपांतरित होस्ट बैक्टीरिया द्वारा बढ़ाया जाता है। या तो एकल सर्वश्रेष्ठ अनुक्रम, या अनुक्रमों का पूल उत्परिवर्तन के अगले वृत्त शैल के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है। विविधीकरण-चयन-प्रवर्धन के दोहराए गए चक्र प्रयुक्त चयन दबावों के अनुकूल प्रोटीन वेरिएंट उत्पन्न करते हैं।
तर्कसंगत प्रोटीन डिजाइन की तुलना
निर्देशित विकास के लाभ
प्रोटीन का प्रोटीन डिज़ाइन प्रोटीन संरचना, साथ ही इसके उत्प्रेरक तंत्र के गहन ज्ञान पर निर्भर करता है।[28][29] पुनः प्रोटीन के कार्य को परिवर्तन ने के प्रयास में साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन द्वारा विशिष्ट परिवर्तन किए जाते हैं। इसका दोष यह है कि तथापि प्रोटीन की संरचना और क्रिया का तंत्र सही प्रकार से ज्ञात हो, फिर भी उत्परिवर्तन के कारण होने वाले परिवर्तन की भविष्यवाणी करना कठिन है। इसलिए, डीई का लाभ यह है कि वांछित गतिविधि के तंत्र को समझने की आवश्यकता नहीं है या उत्परिवर्तन इसे कैसे प्रभावित करते है।[30]
निर्देशित विकास की सीमाएँ
निर्देशित विकास का प्रतिबंध यह है कि उच्च संख्या में विभिन्न यादृच्छिक उत्परिवर्तनों के प्रभावों को मापने के लिए उच्च-थ्रूपुट परख की आवश्यकता होती है। निर्देशित विकास के लिए उपयोग किए जाने से पहले इसके लिए व्यापक अनुसंधान और विकास की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, ऐसे परीक्षण प्रायः किसी विशेष गतिविधि की निगरानी के लिए अत्यधिक विशिष्ट होते हैं और इसलिए इन्हें नए डीई प्रयोगों में स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है।[31]
इसके अतिरिक्त, परख कार्य में सुधार के लिए चयन करने से परख कार्य में सुधार उत्पन्न होता है। यह समझने के लिए कि ये सुधार कैसे प्राप्त किए जाते हैं, विकसित हो रहे एंजाइम के गुणों को मापना होता है। और परख गतिविधि में सुधार एंजाइम उत्प्रेरक गतिविधि या एंजाइम एकाग्रता में सुधार के कारण हो सकता है। इस तथ्य का भी कोई प्रमाण नहीं है कि सब्सट्रेट पर सुधार से दूसरे सब्सट्रेट पर गतिविधि में सुधार होगा। यह विशेष रूप से तब महत्वपूर्ण होता है जब वांछित गतिविधि की सीधे जांच या चयन नहीं किया जा सकता है और इसलिए 'प्रॉक्सी' सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है। वांछित गतिविधि में सुधार किए बिना डीई प्रॉक्सी को विकासवादी विशेषज्ञता प्रदान कर सकता है। अतः परिणामस्वरुप, सफल डीई के लिए उचित स्क्रीनिंग या चयन नियम का चयन करना महत्वपूर्ण है।[32]
किसी प्रयोग में विकास की गति भी निर्देशित विकास की उपयोगिता पर सीमा उत्पन्न करती है। उदाहरण के लिए, किसी विशेष फेनोटाइप का विकास सैद्धांतिक रूप से संभव होते हुए भी समय-माप पर हो सकता है जो व्यावहारिक रूप से संभव नहीं है।[33] वर्तमान के सैद्धांतिक दृष्टिकोणों का उद्देश्य सांख्यिकीय भौतिकी से एडियाबेटिकिटी काउंटर-डायबिटिक ड्राइविंग तकनीकों के शॉर्टकट के अनुप्रयोग के माध्यम से गति की सीमा को दूर करना है, चूंकि इसे अभी तक निर्देशित विकास प्रयोग में प्रयुक्त नहीं किया गया है।[34]
संयुक्त दृष्टिकोण
तर्कसंगत डिजाइन और निर्देशित विकास दोनों की सीमाओं को संबोधित करने के लिए संयुक्त, 'अर्ध-तर्कसंगत' दृष्टिकोण की जांच की जा रही है।[1][35] लाभकारी उत्परिवर्तन दुर्लभ हैं, इसलिए उत्तम वेरिएंट खोजने के लिए उच्च संख्या में यादृच्छिक म्यूटेंट की जांच करनी होती है। 'केंद्रित लाइब्रेरी' डीई के उत्परिवर्तन चरण के लिए लाभकारी उत्परिवर्तन में समृद्ध माने जाने वाले यादृच्छिक क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। केंद्रित लाइब्रेरी में पारंपरिक यादृच्छिक उत्परिवर्तन लाइब्रेरी की तुलना में कम वेरिएंट होते हैं और इसलिए ऐसी उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की आवश्यकता नहीं होती है।
एक केंद्रित लाइब्रेरी बनाने के लिए कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती है कि संरचना में किन अवशेषों को परिवर्तन ना है। इस प्रकार से उदाहरण के लिए, किसी एंजाइम की सक्रिय साइट का ज्ञान एंजाइम सब्सट्रेट (जीव विज्ञान) के साथ वार्तालाप करने के लिए ज्ञात अवशेषों को यादृच्छिक बनाने की अनुमति दे सकता है।[36][37] वैकल्पिक रूप से, प्रकृति में कौन से प्रोटीन क्षेत्र पृथक्करण स्थल हैं, इसका ज्ञान केवल उन क्षेत्रों में उत्परिवर्तन का मार्गदर्शन कर सकता है।[38][39]
अनुप्रयोग
इस प्रकार से तर्कसंगत डिजाइन के विकल्प के रूप में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए प्रायः निर्देशित विकास का उपयोग किया जाता है,[40] किन्तु इसका उपयोग एंजाइम विकास के मूलभूत प्रश्नों की जांच के लिए भी किया जा सकता है।[41]
प्रोटीन इंजीनियरिंग
प्रोटीन इंजीनियरिंग उपकरण के रूप में, डीई तीन क्षेत्रों में अधिक सफल रहा है:
- उच्च तापमान या कठोर सॉल्वैंट्स में जैव प्रौद्योगिकी उपयोग के लिए प्रोटीन स्थिरता में सुधार[42][43][44]
- मोनोक्लोनल एंटीबॉडी थेरेपी की बाध्यकारी आत्मीयता में सुधार (एफ़िनिटी परिपक्वता)[45] और डे नोवो प्रोटीन डिज़ाइन की गतिविधि[30] या उपस्तिथ एंजाइमों की सब्सट्रेट विशिष्टता को परिवर्तन ना (प्रायः उद्योग में उपयोग के लिए) है,[46][47][48][49] [40]
विकास अध्ययन
प्राकृतिक विकास का अध्ययन परंपरागत रूप से उपस्तिथ जीवों और उनके जीन पर आधारित है। चूंकि, अनुसंधान मूल रूप से जीवाश्म की कमी (और विशेष रूप से प्राचीन डीएनए अनुक्रमों की कमी) के कारण सीमित है।[50][51] और प्राचीन पर्यावरणीय परिस्थितियों का अधूरा ज्ञान है। अतः निर्देशित विकास व्यक्तिगत एंजाइमों के लिए जीन की नियंत्रित प्रणाली में विकास की जांच करता है,[52][53][35] राइबोजाइम[54] और प्रतिकृतियां (विकास इकाई)[55][3] ( यूकेरियोट्स के प्रायोगिक विकास के समान,[56][57] प्रोकैर्योसाइटों[58] और वायरस[59]) है.
अतः डीई चयन दबाव, उत्परिवर्तन दर और पर्यावरण (जैवभौतिकीय) (दोनों अजैविक घटक जैसे तापमान, और जैविक वातावरण, जैसे जीव में अन्य जीन) के नियंत्रण की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, सभी विकासवादी मध्यवर्ती जीनों का पूर्ण रिकॉर्ड है। यह विकासवादी प्रक्रियाओं के विस्तृत माप की अनुमति देता है, इस प्रकार से उदाहरण के लिए एपिस्टासिस, विकासात्मकता, अनुकूलनवाद या आनुवंशिक बाधाएं[60][61] फिटनेस परिदृश्य,[62] और तटस्थ नेटवर्क है।[63]
माइक्रोबियल प्रोटीओम का अनुकूली प्रयोगशाला विकास
प्रोटिओम की प्राकृतिक अमीनो एसिड संरचना को प्रयोगात्मक रूप से लगाए गए चयनात्मक दबाव के अधीन उपयुक्त गैर-विहित समकक्षों के साथ वैश्विक विहित अमीनो एसिड प्रतिस्थापन द्वारा परिवर्तन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एस्चेरिचिया कोलाई में फ्लोरिनेटेड एनालॉग्स के साथ प्राकृतिक अमीनो एसिड के वैश्विक प्रोटीन-व्यापक प्रतिस्थापन का प्रयास किया गया है।[64] [65] और बैसिलस सबटिलिस में फ्लोरिनेटेड एनालॉग्स के साथ प्राकृतिक अमीनो एसिड के वैश्विक प्रोटिओम-व्यापक प्रतिस्थापन का प्रयास किया गया है। एस्चेरिचिया कोली में 20899 यूजीजी कोडन के उत्तर में थिएनोपाइरोले-अलैनिन के साथ पूर्ण ट्रिप्टोफैन प्रतिस्थापन की रिपोर्ट 2015 में बुडिसा और डाइटर सॉल सोल द्वारा की गई थी।[66] अतिरिक्त अमीनो एसिड के स्पष्ट आवास के साथ माइक्रोबियल उपभेदों का प्रयोगात्मक विकास प्रयोगात्मक रूप से आनुवंशिक कोड को व्यापक बनाने में सहायक होने की आशा है।[67] किन्तु निर्देशित विकास सामान्यतः उत्परिवर्तन के लिए विशेष जीन को लक्षित करता है और पुनः परिणामी वेरिएंट को रुचि के फेनोटाइप के लिए स्क्रीन करता है, जो प्रायः फिटनेस (जीव विज्ञान) प्रभावों से स्वतंत्र होता है, जबकि अनुकूली प्रयोगशाला विकास अनेक जीनोम-व्यापी उत्परिवर्तन का चयन करता है जो सक्रिय रूप से बढ़ती संस्कृतियों की फिटनेस में योगदान करते हैं।[68]
यह भी देखें
- एप्लीकेशन:
- प्रोटीन इंजीनियरिंग
- एंजाइम इंजीनियरिंग
- प्रोटीन डिजाइन
- विस्तारित आनुवंशिक कोड
- ज़ेनोबायोलॉजी
- उत्परिवर्तन:
- यादृच्छिक उत्परिवर्तन
- संतृप्त उत्परिवर्तन
- क्रमबद्ध विस्तार प्रक्रिया
- चयन और स्क्रीनिंग:
- ख़मीर प्रदर्शन
- जीवाणु प्रदर्शन
- फेज डिस्प्ले
- राइबोसोम प्रदर्शन
- एमआरएनए डिस्प्ले
- एफएसीएस
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बाहरी संबंध
- Research groups
- The Dan Tawfik Research Group
- The Ulrich Schwaneberg Research Group
- The Frances Arnold Research Group
- The Huimin Zhao Research Group
- The Manfred Reetz Research Group
- The Donald Hilvert Group
- The Darren Hart Research Group
- The Chang Liu Research Group
- The David Liu Research Group
- The Douglas Clark Research Group
- The Paul Dalby Research Group
- The Ned Budisa Research Group
- SeSaM-Biotech - Directed Evolution
- Prof. Reetz explains the principle of Directed Evolution
- Codexis, Inc.
