प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी: Difference between revisions

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{{Short description|Type of electromagnetic spectroscopy}}
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[[File:PSA 2.jpg|thumb|[[पारा (तत्व)]] के निर्धारण के लिए परमाणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषक]]प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी (जिसे फ्लोरीमेट्री या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमेट्री के रूप में भी जाना जाता है) एक प्रकार का [[विद्युत चुम्बकीय स्पेक्ट्रोस्कोपी]] है जो एक नमूने से प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करता है। इसमें प्रकाश की एक किरण, आमतौर पर [[पराबैंगनी प्रकाश]] का उपयोग करना शामिल है, जो कुछ यौगिकों के [[अणुओं]] में इलेक्ट्रॉनों को उत्तेजित करता है और उन्हें प्रकाश का उत्सर्जन करने का कारण बनता है; आम तौर पर, लेकिन जरूरी नहीं, दृश्य प्रकाश। एक पूरक तकनीक [[अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी]] है। एकल अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के विशेष मामले में, उत्सर्जित प्रकाश से तीव्रता में उतार-चढ़ाव या तो एकल फ्लोरोफोरस, या फ्लोरोफोरस के जोड़े से मापा जाता है।
[[File:PSA 2.jpg|thumb|[[पारा (तत्व)]] के निर्धारण के लिए परमाणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषक]]प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी (जिसे फ्लोरीमेट्री या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमेट्री के रूप में भी जाना जाता है) एक प्रकार का [[विद्युत चुम्बकीय स्पेक्ट्रोस्कोपी]] है जो एक नमूने से प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करता है। इसमें प्रकाश की एक किरण, सामान्यतः  [[पराबैंगनी प्रकाश]] का उपयोग करना सम्मिलित  है, जो कुछ यौगिकों के [[अणुओं]] में इलेक्ट्रॉनों को उत्तेजित करता है और उन्हें प्रकाश का उत्सर्जन करने का कारण बनता है; सामान्यतः , किंतु  जरूरी नहीं, दृश्य प्रकाश हो । एक पूरक विधि [[अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी]] है। एकल अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के विशेष स्थिति में, उत्सर्जित प्रकाश से तीव्रता में उतार-चढ़ाव या तो एकल फ्लोरोफोरस, या फ्लोरोफोरस के जोड़े से मापा जाता है।


प्रतिदीप्ति को मापने वाले उपकरणों को [[फ्लोरोमीटर]] कहा जाता है।
प्रतिदीप्ति को मापने वाले उपकरणों को [[फ्लोरोमीटर]] कहा जाता है।


== सिद्धांत ==
== सिद्धांत ==
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अणु में विभिन्न अवस्थाएँ होती हैं जिन्हें ऊर्जा स्तर कहा जाता है। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉनिक और कंपन अवस्थाओं से संबंधित है। आम तौर पर, जिन प्रजातियों की जांच की जा रही है, उनमें एक स्थिर स्थिति (कम ऊर्जा की स्थिति) और उच्च ऊर्जा की एक उत्तेजित इलेक्ट्रॉनिक स्थिति होती है। इनमें से प्रत्येक इलेक्ट्रॉनिक अवस्था के भीतर विभिन्न कंपन अवस्थाएँ होती हैं। <ref name="mehta">[http://pharmaxchange.info/press/2013/03/animation-for-the-principle-of-fluorescence-and-uv-visible-absorbance/ Animation for the principle of fluorescence and UV-visible absorbance]</ref>
अणु में विभिन्न अवस्थाएँ होती हैं जिन्हें ऊर्जा स्तर कहा जाता है। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉनिक और कंपन अवस्थाओं से संबंधित है। सामान्यतः , जिन प्रजातियों की जांच की जा रही है, उनमें एक स्थिर स्थिति (कम ऊर्जा की स्थिति) और उच्च ऊर्जा की एक उत्तेजित इलेक्ट्रॉनिक स्थिति होती है। इनमें से प्रत्येक इलेक्ट्रॉनिक अवस्था के अंदर विभिन्न कंपन अवस्थाएँ होती हैं। <ref name="mehta">[http://pharmaxchange.info/press/2013/03/animation-for-the-principle-of-fluorescence-and-uv-visible-absorbance/ Animation for the principle of fluorescence and UV-visible absorbance]</ref>


फ्लोरोसेंस में, प्रजाति सबसे पहले उत्तेजित होती है, एक फोटॉन को अवशोषित करके, इसकी जमीनी इलेक्ट्रॉनिक अवस्था से उत्तेजित इलेक्ट्रॉनिक अवस्था में विभिन्न कंपन अवस्थाओं में से एक में। अन्य अणुओं के साथ टकराव उत्तेजित अणु को कंपन ऊर्जा खोने का कारण बनता है जब तक कि यह उत्साहित इलेक्ट्रॉनिक राज्य से निम्नतम कंपन स्थिति तक नहीं पहुंच जाता। इस प्रक्रिया को अक्सर Jablonski आरेख के साथ देखा जाता है।<ref name="mehta" />
फ्लोरोसेंस में, प्रजाति सबसे पहले उत्तेजित होती है, एक फोटॉन को अवशोषित करके, इसकी समतल इलेक्ट्रॉनिक अवस्था से उत्तेजित इलेक्ट्रॉनिक अवस्था में विभिन्न कंपन अवस्थाओं में से एक में है। अन्य अणुओं के साथ टकराव उत्तेजित अणु को कंपन ऊर्जा खोने का कारण बनता है जब तक कि यह उत्साहित इलेक्ट्रॉनिक स्थिति से निम्नतम कंपन स्थिति तक नहीं पहुंच जाता है। इस प्रक्रिया को प्रायः जब्लोन्स्की आरेख के साथ देखा जाता है।<ref name="mehta" />


अणु फिर जमीनी इलेक्ट्रॉनिक स्थिति के विभिन्न कंपन स्तरों में से एक में गिर जाता है, इस प्रक्रिया में एक फोटॉन का उत्सर्जन होता है। <ref name="mehta" /> जैसा कि अणु जमीनी अवस्था में कई कंपन स्तरों में नीचे गिर सकते हैं, उत्सर्जित फोटॉनों में अलग-अलग ऊर्जाएं होंगी, और इस प्रकार आवृत्तियां होंगी। इसलिए, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी में उत्सर्जित प्रकाश की विभिन्न आवृत्तियों का विश्लेषण करके, उनकी सापेक्ष तीव्रता के साथ, विभिन्न कंपन स्तरों की संरचना निर्धारित की जा सकती है।
अणु फिर समतल इलेक्ट्रॉनिक स्थिति के विभिन्न कंपन स्तरों में से एक में गिर जाता है, इस प्रक्रिया में एक फोटॉन का उत्सर्जन होता है। <ref name="mehta" /> जैसा कि अणु समतल अवस्था में कई कंपन स्तरों में नीचे गिर सकते हैं, उत्सर्जित फोटॉनों में अलग-अलग ऊर्जाएं होंगी, और इस प्रकार आवृत्तियां होंगी। इसलिए, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी में उत्सर्जित प्रकाश की विभिन्न आवृत्तियों का विश्लेषण करके उनकी सापेक्ष तीव्रता के साथ, विभिन्न कंपन स्तरों की संरचना निर्धारित की जा सकती है।


परमाणु प्रजातियों के लिए, प्रक्रिया समान है; हालाँकि, चूंकि परमाणु प्रजातियों में कंपन ऊर्जा का स्तर नहीं होता है, उत्सर्जित फोटॉन अक्सर घटना विकिरण के समान तरंग दैर्ध्य पर होते हैं। अवशोषित फोटॉन को फिर से उत्सर्जित करने की यह प्रक्रिया प्रतिध्वनि प्रतिदीप्ति है और जबकि यह परमाणु प्रतिदीप्ति की विशेषता है, आणविक प्रतिदीप्ति में भी देखी जाती है।<ref>''Principles Of Instrumental Analysis''  F.James Holler, Douglas A. Skoog & Stanley R. Crouch 2006</ref>
परमाणु प्रजातियों के लिए, प्रक्रिया समान है; चूंकि परमाणु प्रजातियों में कंपन ऊर्जा का स्तर नहीं होता है, उत्सर्जित फोटॉन प्रायः घटना विकिरण के समान तरंग दैर्ध्य पर होते हैं। अवशोषित फोटॉन को फिर से उत्सर्जित करने की यह प्रक्रिया प्रतिध्वनि प्रतिदीप्ति है और जबकि यह परमाणु प्रतिदीप्ति की विशेषता है, आणविक प्रतिदीप्ति में भी देखी जाती है।<ref>''Principles Of Instrumental Analysis''  F.James Holler, Douglas A. Skoog & Stanley R. Crouch 2006</ref>


एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति (उत्सर्जन) माप में, उत्तेजना तरंगदैर्घ्य निश्चित होता है और पता लगाने की तरंग दैर्ध्य भिन्न होती है, जबकि एक प्रतिदीप्ति उत्तेजना माप में पता लगाने की तरंग दैर्ध्य तय होती है और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ब्याज के क्षेत्र में भिन्न होता है। एक उत्सर्जन मानचित्र को उत्तेजन तरंगदैर्घ्य की एक श्रृंखला से उत्पन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करके और उन सभी को एक साथ जोड़कर मापा जाता है। यह एक तीन आयामी सतह डेटा सेट है: उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक समारोह के रूप में उत्सर्जन की तीव्रता, और आमतौर पर एक समोच्च मानचित्र के रूप में दर्शाया गया है।
एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति (उत्सर्जन) माप में, उत्तेजना तरंगदैर्घ्य निश्चित होता है और पता लगाने की तरंग दैर्ध्य भिन्न होती है, जबकि एक प्रतिदीप्ति उत्तेजना माप में पता लगाने की तरंग दैर्ध्य तय होती है और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ब्याज के क्षेत्र में भिन्न होता है। एक उत्सर्जन मानचित्र को उत्तेजन तरंगदैर्घ्य की एक श्रृंखला से उत्पन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को सूची करके और उन सभी को एक साथ जोड़कर मापा जाता है। यह एक तीन आयामी सतह डेटा समूह  है: उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक कार्य के रूप में उत्सर्जन की तीव्रता और सामान्यतः  एक समोच्च मानचित्र के रूप में दर्शाया गया है।


== इंस्ट्रूमेंटेशन ==
== उपकरण ==
दो सामान्य प्रकार के उपकरण मौजूद हैं: [[फिल्टर फ्लोरोमीटर]] जो विक्षनरी को अलग करने के लिए फिल्टर का उपयोग करते हैं: घटना प्रकाश और प्रतिदीप्ति प्रकाश और [[ spectrofluorometer ]] जो घटना प्रकाश और फ्लोरोसेंट प्रकाश को अलग करने के लिए विवर्तन झंझरी [[मोनोक्रोमेटर]] का उपयोग करते हैं।
दो सामान्य प्रकार के उपकरण उपस्थित हैं: [[फिल्टर फ्लोरोमीटर|प्रकीर्णन फ्लोरोमीटर]] जो विक्षनरी को अलग करने के लिए प्रकीर्णन का उपयोग करते हैं: घटना प्रकाश और प्रतिदीप्ति प्रकाश और [[ spectrofluorometer | स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर]] जो घटना प्रकाश और फ्लोरोसेंट प्रकाश को अलग करने के लिए विवर्तन सख्त [[मोनोक्रोमेटर]] का उपयोग करते हैं।


दोनों प्रकार निम्नलिखित योजना का उपयोग करते हैं: एक उत्तेजना स्रोत से प्रकाश एक फिल्टर या मोनोक्रोमेटर से होकर गुजरता है, और नमूने पर प्रहार करता है। आपतित प्रकाश का एक अनुपात नमूने द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है, और नमूने के कुछ अणु प्रतिदीप्त हो जाते हैं। फ्लोरोसेंट रोशनी सभी दिशाओं में उत्सर्जित होती है। इस फ्लोरोसेंट प्रकाश में से कुछ एक दूसरे फिल्टर या मोनोक्रोमेटर के माध्यम से गुजरता है और एक डिटेक्टर तक पहुंचता है, जो आमतौर पर संचरित या परावर्तित घटना प्रकाश के डिटेक्टर तक पहुंचने के जोखिम को कम करने के लिए घटना प्रकाश किरण के 90 डिग्री पर रखा जाता है।
दोनों प्रकार निम्नलिखित योजना का उपयोग करते हैं: एक उत्तेजना स्रोत से प्रकाश एक प्रकीर्णन या मोनोक्रोमेटर से होकर गुजरता है, और नमूने पर प्रहार करता है। आपतित प्रकाश का एक अनुपात नमूने द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है, और नमूने के कुछ अणु प्रतिदीप्त हो जाते हैं। फ्लोरोसेंट प्रकाश सभी दिशाओं में उत्सर्जित होती है। इस फ्लोरोसेंट प्रकाश में से कुछ एक दूसरे प्रकीर्णन या मोनोक्रोमेटर के माध्यम से गुजरता है और एक संसूचक तक पहुंचता है, जो सामान्यतः  संचरित या परावर्तित घटना प्रकाश के संसूचक तक पहुंचने के कठिन परिस्थिति को कम करने के लिए घटना प्रकाश किरण के 90 डिग्री पर रखा जाता है।
[[File:Fluorimeter.svg|thumb|right|फ्लोरीमीटर के घटकों का एक सरल डिजाइन]]विभिन्न प्रकाश स्रोतों का उपयोग उत्तेजना स्रोतों के रूप में किया जा सकता है, जिसमें लेजर, एलईडी और लैंप शामिल हैं; [[क्सीनन चाप दीपक]] और विशेष रूप से पारा-वाष्प लैंप। एक लेज़र बहुत संकीर्ण तरंग दैर्ध्य अंतराल पर, आमतौर पर 0.01 एनएम के तहत केवल उच्च विकिरण का प्रकाश उत्सर्जित करता है, जो एक उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या फ़िल्टर को अनावश्यक बनाता है। इस पद्धति का नुकसान यह है कि लेजर की तरंग दैर्ध्य को ज्यादा नहीं बदला जा सकता है। एक मरकरी वेपर लैम्प एक लाइन लैम्प है, जिसका अर्थ है कि यह अधिकतम तरंगदैर्घ्य के निकट प्रकाश उत्सर्जित करता है। इसके विपरीत, एक क्सीनन चाप में 300-800 एनएम की सीमा में लगभग निरंतर तीव्रता वाला एक निरंतर उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है और माप के लिए पर्याप्त विकिरण 200 एनएम से थोड़ा ऊपर होता है।


फ्लोरीमीटर में फिल्टर और/या मोनोक्रोमेटर्स का उपयोग किया जा सकता है। एक मोनोक्रोमेटर एक समायोज्य सहिष्णुता के साथ एक समायोज्य तरंग दैर्ध्य का प्रकाश प्रसारित करता है। मोनोक्रोमेटर का सबसे आम प्रकार एक विवर्तन झंझरी का उपयोग करता है, अर्थात, [[संपार्श्विक]] प्रकाश एक झंझरी को रोशन करता है और तरंग दैर्ध्य के आधार पर एक अलग कोण से बाहर निकलता है। तब मोनोक्रोमेटर को यह चुनने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि किस तरंगदैर्घ्य को संचारित करना है। अनिसोट्रॉपी माप की अनुमति देने के लिए, दो ध्रुवीकरण फिल्टरों को जोड़ना आवश्यक है: एक उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या फिल्टर के बाद, और एक उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर या फिल्टर से पहले।
[[File:Fluorimeter.svg|thumb|right|फ्लोरीमीटर के घटकों का एक सरल डिजाइन]]विभिन्न प्रकाश स्रोतों का उपयोग उत्तेजना स्रोतों के रूप में किया जा सकता है, जिसमें लेजर, एलईडी और लैंप सम्मिलित  हैं; [[क्सीनन चाप दीपक|क्सीनन चाप लैंप]] और विशेष रूप से पारा-वाष्प लैंप एक लेज़र बहुत संकीर्ण तरंग दैर्ध्य अंतराल पर, सामान्यतः  0.01 एनएम के तहत केवल उच्च विकिरण का प्रकाश उत्सर्जित करता है, जो एक उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन  को अनावश्यक बनाता है। इस पद्धति का हानि  यह है कि लेजर की तरंग दैर्ध्य को ज्यादा नहीं बदला जा सकता है। एक मरकरी वेपर लैम्प एक लाइन लैम्प है, जिसका अर्थ है कि यह अधिकतम तरंगदैर्घ्य के निकट प्रकाश उत्सर्जित करता है। इसके विपरीत, एक क्सीनन चाप में 300-800 एनएम की सीमा में लगभग निरंतर तीव्रता वाला एक निरंतर उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है और माप के लिए पर्याप्त विकिरण 200 एनएम से थोड़ा ऊपर होता है।


जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रतिदीप्ति को अक्सर उत्तेजना प्रकाश के सापेक्ष 90 डिग्री के कोण पर मापा जाता है। संचरित उत्तेजना प्रकाश के हस्तक्षेप से बचने के लिए 180 डिग्री कोण पर उत्तेजना प्रकाश की रेखा पर सेंसर रखने के बजाय इस ज्यामिति का उपयोग किया जाता है। कोई मोनोक्रोमेटर सही नहीं है और यह कुछ भटके हुए प्रकाश को प्रसारित करेगा, यानी लक्षित की तुलना में अन्य तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश। एक आदर्श मोनोक्रोमेटर केवल निर्दिष्ट सीमा में प्रकाश संचारित करेगा और एक उच्च तरंग दैर्ध्य-स्वतंत्र संचरण होगा। 90° के कोण पर मापते समय, केवल नमूने द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश ही [[आवारा प्रकाश]] का कारण बनता है। इसका परिणाम बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात में होता है, और पता लगाने की सीमा लगभग 10000 तक कम हो जाती है,<ref>Rendell, D. (1987). Fluorescence and Phosphorescence. Crown</ref> 180° ज्यामिति की तुलना में। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति को सामने से भी मापा जा सकता है, जो अक्सर टर्बिड या अपारदर्शी नमूनों के लिए किया जाता है
फ्लोरीमीटर में प्रकीर्णन और/या मोनोक्रोमेटर्स का उपयोग किया जा सकता है। एक मोनोक्रोमेटर एक समायोज्य सहिष्णुता के साथ एक समायोज्य तरंग दैर्ध्य का प्रकाश प्रसारित करता है। मोनोक्रोमेटर का सबसे सामान्य  प्रकार एक विवर्तन सख्त का उपयोग करता है, अर्थात, [[संपार्श्विक]] प्रकाश एक सख्त को प्रकाशित करता है और तरंग दैर्ध्य के आधार पर एक अलग कोण से बाहर निकलता है। तब मोनोक्रोमेटर को यह चुनने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि किस तरंगदैर्घ्य को संचारित करना है। अनिसोट्रॉपी माप की अनुमति देने के लिए दो ध्रुवीकरण प्रकीर्णन को जोड़ना आवश्यक है: एक उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन के बाद, और एक उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन से पहले है ।
 
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रतिदीप्ति को प्रायः उत्तेजना प्रकाश के सापेक्ष 90 डिग्री के कोण पर मापा जाता है। संचरित उत्तेजना प्रकाश के हस्तक्षेप से बचने के लिए 180 डिग्री कोण पर उत्तेजना प्रकाश की रेखा पर सेंसर रखने के अतिरिक्त इस ज्यामिति का उपयोग किया जाता है। कोई मोनोक्रोमेटर सही नहीं है और यह कुछ निकले हुए प्रकाश को प्रसारित करेगा, जिससे लक्षित की तुलना में अन्य तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश एक आदर्श मोनोक्रोमेटर केवल निर्दिष्ट सीमा में प्रकाश संचारित करेगा और एक उच्च तरंग दैर्ध्य-स्वतंत्र संचरण होगा। 90° के कोण पर मापते समय, केवल नमूने द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश ही [[आवारा प्रकाश]] का कारण बनता है। इसका परिणाम बेहतर ध्वनि -से -संकेत अनुपात में होता है, और पता लगाने की सीमा लगभग 10000 तक कम हो जाती है,<ref>Rendell, D. (1987). Fluorescence and Phosphorescence. Crown</ref> 180° ज्यामिति की तुलना में। इसके अतिरिक्त , प्रतिदीप्ति को सामने से भी मापा जा सकता है, जो प्रायः टर्बिड या अपारदर्शी नमूनों के लिए किया जाता है


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डिटेक्टर या तो सिंगल-चैनल या मल्टीचैनल हो सकता है। एकल-चैनल वाला डिटेक्टर एक समय में केवल एक तरंग दैर्ध्य की तीव्रता का पता लगा सकता है, जबकि बहु-चैनल वाला एक साथ सभी तरंग दैर्ध्य की तीव्रता का पता लगाता है, जिससे उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर या फ़िल्टर अनावश्यक हो जाता है।
संसूचक या तो एकल -चैनल या बहु चैनल हो सकता है। एकल-चैनल वाला संसूचक एक समय में केवल एक तरंग दैर्ध्य की तीव्रता का पता लगा सकता है, जबकि बहु-चैनल वाला एक साथ सभी तरंग दैर्ध्य की तीव्रता का पता लगाता है, जिससे उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन  अनावश्यक हो जाता है।


दोहरे मोनोक्रोमेटर्स और एक सतत उत्तेजना प्रकाश स्रोत के साथ सबसे बहुमुखी फ्लोरीमीटर एक उत्तेजना स्पेक्ट्रम और एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम दोनों को रिकॉर्ड कर सकते हैं। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा को मापते समय, उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को स्थिर रखा जाता है, अधिमानतः उच्च अवशोषण की तरंग दैर्ध्य पर, और उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर स्पेक्ट्रम को स्कैन करता है। उत्तेजना स्पेक्ट्रा को मापने के लिए, उत्सर्जन फिल्टर या मोनोक्रोमेटर से गुजरने वाली तरंग दैर्ध्य को स्थिर रखा जाता है और उत्तेजना मोनोक्रोमेटर स्कैन कर रहा है। उत्तेजना स्पेक्ट्रम आमतौर पर अवशोषण स्पेक्ट्रम के समान होता है क्योंकि प्रतिदीप्ति तीव्रता अवशोषण के समानुपाती होती है।<ref name="Sharma, A 1999">{{cite book|author1=Ashutosh Sharma|author2=Stephen G. Schulman|title=प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का परिचय|url=https://archive.org/details/introductiontofl0000shar|url-access=registration|date=21 May 1999|publisher=Wiley|isbn=978-0-471-11098-9}}</ref>
दोहरे मोनोक्रोमेटर्स और एक सतत उत्तेजना प्रकाश स्रोत के साथ सबसे बहुमुखी फ्लोरीमीटर एक उत्तेजना स्पेक्ट्रम और एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम दोनों को सूची कर सकते हैं। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा को मापते समय उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को स्थिर रखा जाता है, अधिमानतः उच्च अवशोषण की तरंग दैर्ध्य पर और उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर स्पेक्ट्रम को स्कैन करता है। उत्तेजना स्पेक्ट्रा को मापने के लिए उत्सर्जन प्रकीर्णन या मोनोक्रोमेटर से गुजरने वाली तरंग दैर्ध्य को स्थिर रखा जाता है और उत्तेजना मोनोक्रोमेटर स्कैन कर रहा है। उत्तेजना स्पेक्ट्रम सामान्यतः  अवशोषण स्पेक्ट्रम के समान होता है क्योंकि प्रतिदीप्ति तीव्रता अवशोषण के समानुपाती होती है।<ref name="Sharma, A 1999">{{cite book|author1=Ashutosh Sharma|author2=Stephen G. Schulman|title=प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का परिचय|url=https://archive.org/details/introductiontofl0000shar|url-access=registration|date=21 May 1999|publisher=Wiley|isbn=978-0-471-11098-9}}</ref>
== डेटा का विश्लेषण ==
== डेटा का विश्लेषण ==
[[File:OpenFluor R Skript Export.png|thumb|OpenChrom से [[GNU R]] निर्यात]]
[[File:OpenFluor R Skript Export.png|thumb|OpenChrom से [[GNU R]] निर्यात]]
[[File:OpenFluor models report.png|thumb|पदार्थ मिलान दिखाने वाले [[OpenChrom]] में OpenFluor प्लगइन<ref>{{cite journal|last1=Murphy|first1=Kathleen R.|last2=Stedmon|first2=Colin A.|last3=Wenig|first3=Philip|last4=Bro|first4=Rasmus|title=OpenFluor– an online spectral library of auto-fluorescence by organic compounds in the environment|journal=Anal. Methods|date=2014|volume=6|issue=3|pages=658–661|doi=10.1039/C3AY41935E|url=http://publications.lib.chalmers.se/records/fulltext/194565/local_194565.pdf|doi-access=free}}</ref>]]कम सांद्रता पर प्रतिदीप्ति [[तीव्रता (भौतिकी)]] आमतौर पर [[ फ्लोरोफोरे ]] की सांद्रता के समानुपाती होगी।
[[File:OpenFluor models report.png|thumb|पदार्थ मिलान दिखाने वाले [[OpenChrom]] में OpenFluor प्लगइन<ref>{{cite journal|last1=Murphy|first1=Kathleen R.|last2=Stedmon|first2=Colin A.|last3=Wenig|first3=Philip|last4=Bro|first4=Rasmus|title=OpenFluor– an online spectral library of auto-fluorescence by organic compounds in the environment|journal=Anal. Methods|date=2014|volume=6|issue=3|pages=658–661|doi=10.1039/C3AY41935E|url=http://publications.lib.chalmers.se/records/fulltext/194565/local_194565.pdf|doi-access=free}}</ref>]]कम सांद्रता पर प्रतिदीप्ति [[तीव्रता (भौतिकी)]] सामान्यतः  [[ फ्लोरोफोरे ]] की सांद्रता के समानुपाती होगी।
 
यूवी/दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी के विपरीत, 'मानक', उपकरण स्वतंत्र स्पेक्ट्रा आसानी से प्राप्त नहीं होते हैं। कई कारक स्पेक्ट्रा को प्रभावित और विकृत करते हैं, और 'सही', यानी मशीन-स्वतंत्र, स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए सुधार आवश्यक हैं। विभिन्न प्रकार की विकृतियों को यहाँ या तो उपकरण- या नमूना-संबंधी होने के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा। सर्वप्रथम यंत्र से उत्पन्न विकृति की चर्चा की जाती है। प्रारंभ के रूप में, प्रत्येक प्रयोग के दौरान और प्रत्येक प्रयोग के बीच समय के साथ प्रकाश स्रोत की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य विशेषताएँ बदलती रहती हैं। इसके अलावा, किसी भी दीपक की तीव्रता सभी तरंग दैर्ध्य पर स्थिर नहीं होती है। इसे ठीक करने के लिए, प्रकाश के एक हिस्से को संदर्भ डिटेक्टर पर निर्देशित करने के लिए उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या फ़िल्टर के बाद एक बीम स्प्लिटर लगाया जा सकता है।


इसके अतिरिक्त, मोनोक्रोमेटर्स और फिल्टर की संचरण दक्षता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। समय के साथ इनमें बदलाव भी हो सकता है। मोनोक्रोमेटर की संचरण क्षमता भी तरंग दैर्ध्य के आधार पर भिन्न होती है। यही कारण है कि उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या फ़िल्टर के बाद एक वैकल्पिक संदर्भ डिटेक्टर रखा जाना चाहिए। डिटेक्टर द्वारा उठाए गए फ्लोरोसेंस का प्रतिशत भी सिस्टम पर निर्भर है। इसके अलावा, डिटेक्टर क्वांटम दक्षता, यानी पता लगाए गए फोटॉनों का प्रतिशत, अलग-अलग डिटेक्टरों के बीच, तरंग दैर्ध्य और समय के साथ भिन्न होता है, क्योंकि डिटेक्टर अनिवार्य रूप से बिगड़ता है।
यूवी/दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी के विपरीत, 'मानक', उपकरण स्वतंत्र स्पेक्ट्रा आसानी से प्राप्त नहीं होते हैं। कई कारक स्पेक्ट्रा को प्रभावित और विकृत करते हैं, और 'सही', जिससे मशीन-स्वतंत्र, स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए सुधार आवश्यक हैं। विभिन्न प्रकार की विकृतियों को यहाँ या तो उपकरण- या नमूना-संबंधी होने के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा। सर्वप्रथम यंत्र से उत्पन्न विकृति की चर्चा की जाती है। प्रारंभ के रूप में, प्रत्येक प्रयोग के समय और प्रत्येक प्रयोग के बीच समय के साथ प्रकाश स्रोत की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य विशेषताएँ बदलती रहती हैं। इसके अतिरिक्त , किसी भी लैंप  की तीव्रता सभी तरंग दैर्ध्य पर स्थिर नहीं होती है। इसे ठीक करने के लिए प्रकाश के एक भाग को संदर्भ संसूचक पर निर्देशित करने के लिए उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन  के बाद एक बीम विभाजक  लगाया जा सकता है।


जिन दो अन्य विषयों पर विचार किया जाना चाहिए, उनमें विकिरण को निर्देशित करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रकाशिकी और नमूना सामग्री को धारण करने या रखने के साधन (क्युवेट या सेल कहा जाता है) शामिल हैं। अधिकांश यूवी, दृश्यमान और एनआईआर मापों के लिए सटीक क्वार्ट्ज क्यूवेट्स का उपयोग आवश्यक है। दोनों ही मामलों में, उन सामग्रियों का चयन करना महत्वपूर्ण है जिनका ब्याज की तरंग दैर्ध्य सीमा में अपेक्षाकृत कम अवशोषण होता है। क्वार्ट्ज आदर्श है क्योंकि यह 200 एनएम-2500 एनएम से प्रसारित होता है; उच्च ग्रेड क्वार्ट्ज भी 3500 एनएम तक संचारित कर सकता है, जबकि अन्य सामग्रियों के अवशोषण गुण नमूने से फ्लोरेसेंस को मुखौटा कर सकते हैं।
इसके अतिरिक्त, मोनोक्रोमेटर्स और प्रकीर्णन की संचरण दक्षता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। समय के साथ इनमें बदलाव भी हो सकता है। मोनोक्रोमेटर की संचरण क्षमता भी तरंग दैर्ध्य के आधार पर भिन्न होती है। यही कारण है कि उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन  के बाद एक वैकल्पिक संदर्भ संसूचक रखा जाना चाहिए। संसूचक द्वारा उठाए गए फ्लोरोसेंस का प्रतिशत भी प्रणाली पर निर्भर है। इसके अतिरिक्त , संसूचक क्वांटम दक्षता, जिससे पता लगाए गए फोटॉनों का प्रतिशत, अलग-अलग संसूचको के बीच, तरंग दैर्ध्य और समय के साथ भिन्न होता है, क्योंकि संसूचक अनिवार्य रूप से अशक्त होता है ।


एक 'मानक' स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए इन सभी सहायक कारकों में सुधार एक थकाऊ प्रक्रिया है, जिसे व्यवहार में तभी लागू किया जाता है जब यह अत्यंत आवश्यक हो। क्वांटम उपज को मापने या उदाहरण के लिए उच्चतम उत्सर्जन तीव्रता के साथ तरंग दैर्ध्य खोजने पर यह मामला है।
जिन दो अन्य विषयों पर विचार किया जाना चाहिए, उनमें विकिरण को निर्देशित करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रकाशिकी और नमूना पदार्थ को धारण करने या रखने के साधन (क्युवेट या सेल कहा जाता है) सम्मिलित  हैं। अधिकांश यूवी, दृश्यमान और एनआईआर मापों के लिए स्पष्ट  क्वार्ट्ज क्यूवेट्स का उपयोग आवश्यक है। दोनों ही स्थिति में, उन पदार्थ का चयन करना महत्वपूर्ण है जिनका ब्याज की तरंग दैर्ध्य सीमा में अपेक्षाकृत कम अवशोषण होता है। क्वार्ट्ज आदर्श है क्योंकि यह 200 एनएम-2500 एनएम से प्रसारित होता है; उच्च ग्रेड क्वार्ट्ज भी 3500 एनएम तक संचारित कर सकता है, जबकि अन्य पदार्थ के अवशोषण गुण नमूने से फ्लोरेसेंस को आवरण कर सकते हैं।


जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नमूने से भी विकृतियाँ उत्पन्न होती हैं। इसलिए, नमूने के कुछ पहलुओं को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, फोटोडिकम्पोजिशन समय के साथ प्रतिदीप्ति की तीव्रता को कम कर सकता है। प्रकाश के बिखराव को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस संदर्भ में सबसे महत्वपूर्ण प्रकार के प्रकीर्णन रेले और रमन प्रकीर्णन हैं। [[[[रमन बिखरना]]]] द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य आपतित प्रकाश के समान होती है, जबकि रमन प्रकीर्णन में प्रकीर्णित प्रकाश तरंग दैर्ध्य को आमतौर पर लंबी तरंग दैर्ध्य में बदल देता है। रमन प्रकीर्णन उत्तेजना प्रकाश द्वारा प्रेरित एक आभासी इलेक्ट्रॉनिक स्थिति का परिणाम है। इस [[आभासी स्थिति (भौतिकी)]]भौतिकी) से, अणु कंपन ग्राउंड स्टेट के अलावा किसी कंपन स्तर पर आराम कर सकते हैं।<ref>Gauglitz, G. and Vo-Dinh, T. (2003). Handbook of spectroscopy.
एक 'मानक' स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए इन सभी सहायक कारकों में सुधार एक थकाऊ प्रक्रिया है, जिसे व्यवहार में तभी प्रयुक्त किया जाता है जब यह अत्यंत आवश्यक हो। क्वांटम उपज को मापने या उदाहरण के लिए उच्चतम उत्सर्जन तीव्रता के साथ तरंग दैर्ध्य खोजने पर यह स्थिति है।
Wiley-VCH.</ref> प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में, यह हमेशा उत्तेजना वेवनंबर के सापेक्ष एक स्थिर तरंग संख्या अंतर पर देखा जाता है उदा। चोटी तरंग संख्या 3600 सेमी पर प्रकट होती है<sup>-1 </sup> पानी में उत्तेजना प्रकाश से कम।


अन्य पहलुओं पर विचार करने के लिए आंतरिक फ़िल्टर प्रभाव हैं।<ref>{{Cite journal|last1=Kimball|first1=Joseph|last2=Chavez|first2=Jose|last3=Ceresa|first3=Luca|last4=Kitchner|first4=Emma|last5=Nurekeyev|first5=Zhangatay|last6=Doan|first6=Hung|last7=Szabelski|first7=Mariusz|last8=Borejdo|first8=Julian|last9=Gryczynski|first9=Ignacy|last10=Gryczynski|first10=Zygmunt|date=2020-06-01|title=On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence Part I: primary inner filter effect-the proper approach for sample absorbance correction|url=https://doi.org/10.1088/2050-6120/ab947c|journal=Methods and Applications in Fluorescence|volume=8|issue=3|pages=033002|doi=10.1088/2050-6120/ab947c|pmid=32428893 |bibcode=2020MApFl...8c3002K |s2cid=218758981 |issn=2050-6120}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Ceresa|first1=Luca|last2=Kimball|first2=Joseph|last3=Chavez|first3=Jose|last4=Kitchner|first4=Emma|last5=Nurekeyev|first5=Zhangatay|last6=Doan|first6=Hung|last7=Borejdo|first7=Julian|last8=Gryczynski|first8=Ignacy|last9=Gryczynski|first9=Zygmunt|date=2021-05-24|title=On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence. Part II: secondary inner filter effect -the proper use of front-face configuration for highly absorbing and scattering samples|url=https://doi.org/10.1088/2050-6120/ac0243|journal=Methods and Applications in Fluorescence|volume=9|issue=3|pages=035005|doi=10.1088/2050-6120/ac0243|pmid=34032610 |bibcode=2021MApFl...9c5005C |s2cid=235201243 |issn=2050-6120}}</ref> इनमें पुन: अवशोषण शामिल है। पुनर्अवशोषण इसलिए होता है क्योंकि एक अन्य अणु या मैक्रोमोलेक्यूल का हिस्सा तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित होता है जिस पर फ्लोरोफोर विकिरण उत्सर्जित करता है। यदि यह स्थिति है, तो फ़्लोरोफ़ोर द्वारा उत्सर्जित कुछ या सभी फोटॉनों को फिर से अवशोषित किया जा सकता है। एक अन्य आंतरिक फिल्टर प्रभाव फ्लोरोफोर सहित अवशोषित अणुओं की उच्च सांद्रता के कारण होता है। इसका परिणाम यह होता है कि उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता पूरे समाधान में स्थिर नहीं होती है। नतीजतन, उत्तेजना प्रकाश का केवल एक छोटा प्रतिशत फ्लोरोफोरस तक पहुंचता है जो पहचान प्रणाली के लिए दिखाई दे रहे हैं। आंतरिक फ़िल्टर प्रभाव उत्सर्जित प्रकाश के स्पेक्ट्रम और तीव्रता को बदलते हैं और इसलिए फ्लोरोसेंट प्रकाश के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करते समय उन पर विचार किया जाना चाहिए।<ref name="Sharma, A 1999"/><ref>Lakowicz, J. R. (1999). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic / Plenum Publishers</ref>
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नमूने से भी विकृतियाँ उत्पन्न होती हैं। इसलिए, नमूने के कुछ पहलुओं को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, फोटोडिकम्पोजिशन समय के साथ प्रतिदीप्ति की तीव्रता को कम कर सकता है। प्रकाश के प्रकीर्णन को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस संदर्भ में सबसे महत्वपूर्ण प्रकार के प्रकीर्णन रेले और रमन प्रकीर्णन हैं। [[रमन बिखरना|रमन प्रकीर्णन]] द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य आपतित प्रकाश के समान होती है, जबकि रमन प्रकीर्णन में प्रकीर्णित प्रकाश तरंग दैर्ध्य को सामान्यतः  लंबी तरंग दैर्ध्य में बदल देता है। रमन प्रकीर्णन उत्तेजना प्रकाश द्वारा प्रेरित एक आभासी इलेक्ट्रॉनिक स्थिति का परिणाम है। इस [[आभासी स्थिति (भौतिकी)]] स्टेट के अतिरिक्त  किसी कंपन स्तर पर आराम कर सकते हैं।<ref>Gauglitz, G. and Vo-Dinh, T. (2003). Handbook of spectroscopy.
Wiley-VCH.</ref> प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में, यह हमेशा उत्तेजना तरंग संख्या के सापेक्ष एक स्थिर तरंग संख्या अंतर पर देखा जाता है उदा।  तरंग संख्या में उत्तेजना प्रकाश की तुलना में 3600 सेमी<sup>-1 </sup>कम तरंग संख्या पर दिखाई देती है।


अन्य पहलुओं पर विचार करने के लिए आंतरिक प्रकीर्णन  प्रभाव हैं।<ref>{{Cite journal|last1=Kimball|first1=Joseph|last2=Chavez|first2=Jose|last3=Ceresa|first3=Luca|last4=Kitchner|first4=Emma|last5=Nurekeyev|first5=Zhangatay|last6=Doan|first6=Hung|last7=Szabelski|first7=Mariusz|last8=Borejdo|first8=Julian|last9=Gryczynski|first9=Ignacy|last10=Gryczynski|first10=Zygmunt|date=2020-06-01|title=On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence Part I: primary inner filter effect-the proper approach for sample absorbance correction|url=https://doi.org/10.1088/2050-6120/ab947c|journal=Methods and Applications in Fluorescence|volume=8|issue=3|pages=033002|doi=10.1088/2050-6120/ab947c|pmid=32428893 |bibcode=2020MApFl...8c3002K |s2cid=218758981 |issn=2050-6120}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Ceresa|first1=Luca|last2=Kimball|first2=Joseph|last3=Chavez|first3=Jose|last4=Kitchner|first4=Emma|last5=Nurekeyev|first5=Zhangatay|last6=Doan|first6=Hung|last7=Borejdo|first7=Julian|last8=Gryczynski|first8=Ignacy|last9=Gryczynski|first9=Zygmunt|date=2021-05-24|title=On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence. Part II: secondary inner filter effect -the proper use of front-face configuration for highly absorbing and scattering samples|url=https://doi.org/10.1088/2050-6120/ac0243|journal=Methods and Applications in Fluorescence|volume=9|issue=3|pages=035005|doi=10.1088/2050-6120/ac0243|pmid=34032610 |bibcode=2021MApFl...9c5005C |s2cid=235201243 |issn=2050-6120}}</ref> इनमें पुन: अवशोषण सम्मिलित  है। पुनर्अवशोषण इसलिए होता है क्योंकि एक अन्य अणु या मैक्रोमोलेक्यूल का भाग तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित होता है जिस पर फ्लोरोफोर विकिरण उत्सर्जित करता है। यदि यह स्थिति है, तो फ़्लोरोफ़ोर द्वारा उत्सर्जित कुछ या सभी फोटॉनों को फिर से अवशोषित किया जा सकता है। एक अन्य आंतरिक प्रकीर्णन प्रभाव फ्लोरोफोर सहित अवशोषित अणुओं की उच्च सांद्रता के कारण होता है। इसका परिणाम यह होता है कि उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता पूरे समाधान में स्थिर नहीं होती है। नतीजतन, उत्तेजना प्रकाश का केवल एक छोटा प्रतिशत फ्लोरोफोरस तक पहुंचता है जो पहचान प्रणाली के लिए दिखाई दे रहे हैं। आंतरिक प्रकीर्णन  प्रभाव उत्सर्जित प्रकाश के स्पेक्ट्रम और तीव्रता को बदलते हैं और इसलिए फ्लोरोसेंट प्रकाश के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करते समय उन पर विचार किया जाना चाहिए।<ref name="Sharma, A 1999"/><ref>Lakowicz, J. R. (1999). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic / Plenum Publishers</ref>


== [[ tryptophan ]] प्रतिदीप्ति ==
'''इसलिए फ्लोरोसेंट प्रकाश के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करते समय उन पर विचार किया जाना चाहिए।<ref name="Sharma, A 1999" /><br />'''
मुड़े हुए प्रोटीन का प्रतिदीप्ति व्यक्तिगत सुगंधित अवशेषों से प्रतिदीप्ति का मिश्रण है। मुड़े हुए प्रोटीन के अधिकांश आंतरिक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन ट्रिप्टोफैन अवशेषों के उत्तेजना के कारण होते हैं, कुछ उत्सर्जन टायरोसिन और फेनिलएलनिन के कारण होते हैं; लेकिन इस तरंग दैर्ध्य रेंज में डाइसल्फ़ाइड बांडों का भी प्रशंसनीय अवशोषण होता है। आमतौर पर, ट्रिप्टोफैन में 280 एनएम के अधिकतम अवशोषण की तरंग दैर्ध्य और एक उत्सर्जन शिखर होता है जो [[सॉल्वैटोक्रोमिक]] होता है, सीए से लेकर। स्थानीय वातावरण की ध्रुवीयता के आधार पर 300 से 350 एनएम <ref>[http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/fluor.htm Intrinsic Fluorescence of Proteins and Peptides] {{webarchive|url=https://web.archive.org/web/20100516054153/http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/fluor.htm |date=2010-05-16 }}</ref> इसलिए, प्रोटीन प्रतिदीप्ति का उपयोग प्रोटीन के संचलन की स्थिति के निदान के रूप में किया जा सकता है।<ref name="pmid11325713">{{cite journal|author=Vivian JT, Callis PR |title=ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति के तंत्र प्रोटीन में बदल जाते हैं|journal=Biophys. J. |volume=80 |issue=5 |pages=2093–109 |date=2001 |pmid=11325713 |doi=10.1016/S0006-3495(01)76183-8 |url=http://www.biophysj.org/cgi/content/abstract/80/5/2093 |pmc=1301402 |bibcode=2001BpJ....80.2093V |url-status=dead |archiveurl=https://web.archive.org/web/20080906102026/http://www.biophysj.org/cgi/content/abstract/80/5/2093 |archivedate=September 6, 2008 }}</ref> इसके अलावा, ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति अन्य अवशेषों की निकटता से दृढ़ता से प्रभावित होती है (यानी, एस्प या ग्लू जैसे आस-पास के प्रोटोनेटेड समूह ट्रैप प्रतिदीप्ति के [[शमन (प्रतिदीप्ति)]] का कारण बन सकते हैं)। इसके अलावा, ट्रिप्टोफैन और अन्य फ्लोरोसेंट अमीनो एसिड के बीच ऊर्जा हस्तांतरण संभव है, जो विश्लेषण को प्रभावित करेगा, खासकर उन मामलों में जहां फोर्स्टर अम्लीय दृष्टिकोण लिया जाता है। इसके अलावा, ट्रिप्टोफैन एक अपेक्षाकृत दुर्लभ अमीनो एसिड है; कई प्रोटीनों में केवल एक या कुछ ट्रिप्टोफैन अवशेष होते हैं। इसलिए, ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति अलग-अलग ट्रिप्टोफैन अवशेषों के संचलन की स्थिति का एक बहुत ही संवेदनशील माप हो सकता है। बाह्य जांच की तुलना में लाभ यह है कि प्रोटीन स्वयं परिवर्तित नहीं होता है। प्रोटीन रचना के अध्ययन के लिए आंतरिक प्रतिदीप्ति का उपयोग कुछ (या शायद केवल एक) ट्रिप्टोफैन अवशेषों के मामलों तक सीमित है, क्योंकि प्रत्येक एक अलग स्थानीय वातावरण का अनुभव करता है, जो विभिन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को जन्म देता है।
== [[ tryptophan | ट्रिप्टोफैन]] प्रतिदीप्ति ==
मुड़े हुए प्रोटीन का प्रतिदीप्ति व्यक्तिगत सुगंधित अवशेषों से प्रतिदीप्ति का मिश्रण है। मुड़े हुए प्रोटीन के अधिकांश आंतरिक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन ट्रिप्टोफैन अवशेषों के उत्तेजना के कारण होते हैं, कुछ उत्सर्जन टायरोसिन और फेनिलएलनिन के कारण होते हैं; किंतु  इस तरंग दैर्ध्य रेंज में डाइसल्फ़ाइड बांडों का भी प्रशंसनीय अवशोषण होता है। सामान्यतः , ट्रिप्टोफैन में 280 एनएम के अधिकतम अवशोषण की तरंग दैर्ध्य और एक उत्सर्जन शिखर होता है जो [[सॉल्वैटोक्रोमिक]] होता है, सीए से लेकर। स्थानीय वातावरण की ध्रुवीयता के आधार पर 300 से 350 एनएम <ref>[http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/fluor.htm Intrinsic Fluorescence of Proteins and Peptides] {{webarchive|url=https://web.archive.org/web/20100516054153/http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/fluor.htm |date=2010-05-16 }}</ref> इसलिए, प्रोटीन प्रतिदीप्ति का उपयोग प्रोटीन के संचलन की स्थिति के निदान के रूप में किया जा सकता है।<ref name="pmid11325713">{{cite journal|author=Vivian JT, Callis PR |title=ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति के तंत्र प्रोटीन में बदल जाते हैं|journal=Biophys. J. |volume=80 |issue=5 |pages=2093–109 |date=2001 |pmid=11325713 |doi=10.1016/S0006-3495(01)76183-8 |url=http://www.biophysj.org/cgi/content/abstract/80/5/2093 |pmc=1301402 |bibcode=2001BpJ....80.2093V |url-status=dead |archiveurl=https://web.archive.org/web/20080906102026/http://www.biophysj.org/cgi/content/abstract/80/5/2093 |archivedate=September 6, 2008 }}</ref> इसके अतिरिक्त , ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति अन्य अवशेषों की निकटता से दृढ़ता से प्रभावित होती है (यानी, एस्प या ग्लू जैसे आस-पास के प्रोटोनेटेड समूह ट्रैप प्रतिदीप्ति के [[शमन (प्रतिदीप्ति)]] का कारण बन सकते हैं)। इसके अतिरिक्त , ट्रिप्टोफैन और अन्य फ्लोरोसेंट अमीनो एसिड के बीच ऊर्जा हस्तांतरण संभव है, जो विश्लेषण को प्रभावित करेगा, खासकर उन स्थिति में जहां फोर्स्टर अम्लीय दृष्टिकोण लिया जाता है। इसके अतिरिक्त , ट्रिप्टोफैन एक अपेक्षाकृत दुर्लभ अमीनो एसिड है; कई प्रोटीनों में केवल एक या कुछ ट्रिप्टोफैन अवशेष होते हैं। इसलिए, ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति अलग-अलग ट्रिप्टोफैन अवशेषों के संचलन की स्थिति का एक बहुत ही संवेदनशील माप हो सकता है। बाह्य जांच की तुलना में लाभ यह है कि प्रोटीन स्वयं परिवर्तित नहीं होता है। प्रोटीन रचना के अध्ययन के लिए आंतरिक प्रतिदीप्ति का उपयोग कुछ (या शायद केवल एक) ट्रिप्टोफैन अवशेषों के स्थिति तक सीमित है, क्योंकि प्रत्येक एक अलग स्थानीय वातावरण का अनुभव करता है, जो विभिन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को जन्म देता है।


ट्रिप्टोफैन एक महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरोसेंट (एमिनो एसिड) है, जिसका उपयोग ट्रिप्टोफैन के माइक्रोएन्वायरमेंट की प्रकृति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। डिनेचुरेंट्स, [[ पृष्ठसक्रियकारक ]]्स या अन्य [[amphiphilic]] अणुओं के साथ प्रयोग करते समय, ट्रिप्टोफैन का माइक्रोएन्वायरमेंट बदल सकता है। उदाहरण के लिए, यदि इसके 'हाइड्रोफोबिक' कोर में एकल ट्रिप्टोफैन युक्त प्रोटीन को बढ़ते तापमान के साथ विकृत किया जाता है, तो एक लाल-स्थानांतरित उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दिखाई देगा। यह हाइड्रोफोबिक प्रोटीन इंटीरियर के विपरीत एक जलीय वातावरण में ट्रिप्टोफैन के संपर्क के कारण होता है। इसके विपरीत, एक प्रोटीन के लिए एक सर्फेक्टेंट के अलावा जिसमें एक ट्रिप्टोफैन होता है जो जलीय विलायक के संपर्क में आता है, यदि ट्रिप्टोफैन सर्फेक्टेंट वेसिकल (जीव विज्ञान) या [[मिसेल]] में एम्बेडेड होता है, तो एक ब्लू-शिफ्ट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का कारण होगा।<ref>Caputo GA, London E. ''Cumulative effects of amino acid substitutions and hydrophobic mismatch upon the transmembrane stability and conformation of hydrophobic alpha-helices.''
ट्रिप्टोफैन एक महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरोसेंट (एमिनो एसिड) है, जिसका उपयोग ट्रिप्टोफैन के माइक्रोएन्वायरमेंट की प्रकृति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। डिनेचुरेंट्स, [[ पृष्ठसक्रियकारक ]]्स या अन्य [[amphiphilic]] अणुओं के साथ प्रयोग करते समय, ट्रिप्टोफैन का माइक्रोएन्वायरमेंट बदल सकता है। उदाहरण के लिए, यदि इसके 'हाइड्रोफोबिक' कोर में एकल ट्रिप्टोफैन युक्त प्रोटीन को बढ़ते तापमान के साथ विकृत किया जाता है, तो एक लाल-स्थानांतरित उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दिखाई देगा। यह हाइड्रोफोबिक प्रोटीन इंटीरियर के विपरीत एक जलीय वातावरण में ट्रिप्टोफैन के संपर्क के कारण होता है। इसके विपरीत, एक प्रोटीन के लिए एक सर्फेक्टेंट के अतिरिक्त  जिसमें एक ट्रिप्टोफैन होता है जो जलीय विलायक के संपर्क में आता है, यदि ट्रिप्टोफैन सर्फेक्टेंट वेसिकल (जीव विज्ञान) या [[मिसेल]] में एम्बेडेड होता है, तो एक ब्लू-शिफ्ट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का कारण होगा।<ref>Caputo GA, London E. ''Cumulative effects of amino acid substitutions and hydrophobic mismatch upon the transmembrane stability and conformation of hydrophobic alpha-helices.''
Biochemistry. 2003 Mar 25;42(11):3275-85.</ref> ट्रिप्टोफैन की कमी वाले प्रोटीन को फ्लोरोफोर से जोड़ा जा सकता है।
Biochemistry. 2003 Mar 25;42(11):3275-85.</ref> ट्रिप्टोफैन की कमी वाले प्रोटीन को फ्लोरोफोर से जोड़ा जा सकता है।


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फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कार्बनिक यौगिकों के विश्लेषण के लिए जैव रासायनिक, चिकित्सा और रासायनिक अनुसंधान क्षेत्रों में किया जाता है। घातक त्वचा ट्यूमर को सौम्य से अलग करने में इसके उपयोग की एक रिपोर्ट भी आई है।
फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कार्बनिक यौगिकों के विश्लेषण के लिए जैव रासायनिक, चिकित्सा और रासायनिक अनुसंधान क्षेत्रों में किया जाता है। घातक त्वचा ट्यूमर को सौम्य से अलग करने में इसके उपयोग की एक रिपोर्ट भी आई है।


परमाणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएस) तकनीक हवा या पानी, या अन्य मीडिया में मौजूद यौगिक के अन्य प्रकार के विश्लेषण/माप में उपयोगी होती है, जैसे [[सीवीएएफएस]] जिसका उपयोग पारा जैसे भारी धातुओं का पता लगाने के लिए किया जाता है।
परमाणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएस) विधि हवा या पानी, या अन्य मीडिया में उपस्थित यौगिक के अन्य प्रकार के विश्लेषण/माप में उपयोगी होती है, जैसे [[सीवीएएफएस]] जिसका उपयोग पारा जैसे भारी धातुओं का पता लगाने के लिए किया जाता है।


प्रतिदीप्ति का उपयोग फोटॉनों को पुनर्निर्देशित करने के लिए भी किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट सौर संग्राहक देखें।
प्रतिदीप्ति का उपयोग फोटॉनों को पुनर्निर्देशित करने के लिए भी किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट सौर संग्राहक देखें।
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इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी को [[माइक्रोफ्लोरोमेट्री]] का उपयोग करके सूक्ष्म स्तर पर अनुकूलित किया जा सकता है
इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी को [[माइक्रोफ्लोरोमेट्री]] का उपयोग करके सूक्ष्म स्तर पर अनुकूलित किया जा सकता है


विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में, [[एचपीएलसी]] के साथ प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों का उपयोग किया जाता है।
विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में, [[एचपीएलसी]] के साथ प्रतिदीप्ति संसूचको का उपयोग किया जाता है।


जल अनुसंधान के क्षेत्र में, जैविक प्रदूषकों का पता लगाकर पानी की गुणवत्ता की निगरानी के लिए प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।<ref>{{Cite journal|last1=Carstea|first1=Elfrida M.|last2=Bridgeman|first2=John|last3=Baker|first3=Andy|last4=Reynolds|first4=Darren M.|date=2016-05-15|title=Fluorescence spectroscopy for wastewater monitoring: A review|url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135416301488|journal=Water Research|language=en|volume=95|pages=205–219|doi=10.1016/j.watres.2016.03.021|pmid=26999254|s2cid=205696150 |issn=0043-1354}}</ref> कंप्यूटर विज्ञान और मशीन लर्निंग में हालिया प्रगति ने पानी के जीवाणु संदूषण का पता लगाने में भी सक्षम बनाया है <ref>{{Cite journal|last1=Nakar|first1=Amir|last2=Schmilovitch|first2=Ze’ev|last3=Vaizel-Ohayon|first3=Dalit|last4=Kroupitski|first4=Yulia|last5=Borisover|first5=Mikhail|last6=Sela (Saldinger)|first6=Shlomo|date=2020-02-01|title=प्रतिदीप्ति और उत्तेजना-उत्सर्जन मैट्रिसेस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के पीएलएस विश्लेषण का उपयोग करके पानी में बैक्टीरिया की मात्रा|url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135419309716|journal=Water Research|language=en|volume=169|pages=115197|doi=10.1016/j.watres.2019.115197|pmid=31670087|s2cid=204967767 |issn=0043-1354}}</ref>
जल अनुसंधान के क्षेत्र में, जैविक प्रदूषकों का पता लगाकर पानी की गुणवत्ता की निगरानी के लिए प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।<ref>{{Cite journal|last1=Carstea|first1=Elfrida M.|last2=Bridgeman|first2=John|last3=Baker|first3=Andy|last4=Reynolds|first4=Darren M.|date=2016-05-15|title=Fluorescence spectroscopy for wastewater monitoring: A review|url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135416301488|journal=Water Research|language=en|volume=95|pages=205–219|doi=10.1016/j.watres.2016.03.021|pmid=26999254|s2cid=205696150 |issn=0043-1354}}</ref> कंप्यूटर विज्ञान और मशीन लर्निंग में हालिया प्रगति ने पानी के जीवाणु संदूषण का पता लगाने में भी सक्षम बनाया है <ref>{{Cite journal|last1=Nakar|first1=Amir|last2=Schmilovitch|first2=Ze’ev|last3=Vaizel-Ohayon|first3=Dalit|last4=Kroupitski|first4=Yulia|last5=Borisover|first5=Mikhail|last6=Sela (Saldinger)|first6=Shlomo|date=2020-02-01|title=प्रतिदीप्ति और उत्तेजना-उत्सर्जन मैट्रिसेस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के पीएलएस विश्लेषण का उपयोग करके पानी में बैक्टीरिया की मात्रा|url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135419309716|journal=Water Research|language=en|volume=169|pages=115197|doi=10.1016/j.watres.2019.115197|pmid=31670087|s2cid=204967767 |issn=0043-1354}}</ref>

Revision as of 14:43, 21 April 2023

पारा (तत्व) के निर्धारण के लिए परमाणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषक

प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी (जिसे फ्लोरीमेट्री या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमेट्री के रूप में भी जाना जाता है) एक प्रकार का विद्युत चुम्बकीय स्पेक्ट्रोस्कोपी है जो एक नमूने से प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करता है। इसमें प्रकाश की एक किरण, सामान्यतः पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करना सम्मिलित है, जो कुछ यौगिकों के अणुओं में इलेक्ट्रॉनों को उत्तेजित करता है और उन्हें प्रकाश का उत्सर्जन करने का कारण बनता है; सामान्यतः , किंतु जरूरी नहीं, दृश्य प्रकाश हो । एक पूरक विधि अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी है। एकल अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के विशेष स्थिति में, उत्सर्जित प्रकाश से तीव्रता में उतार-चढ़ाव या तो एकल फ्लोरोफोरस, या फ्लोरोफोरस के जोड़े से मापा जाता है।

प्रतिदीप्ति को मापने वाले उपकरणों को फ्लोरोमीटर कहा जाता है।

सिद्धांत

Main article: प्रतिदीप्ति

अणु में विभिन्न अवस्थाएँ होती हैं जिन्हें ऊर्जा स्तर कहा जाता है। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉनिक और कंपन अवस्थाओं से संबंधित है। सामान्यतः , जिन प्रजातियों की जांच की जा रही है, उनमें एक स्थिर स्थिति (कम ऊर्जा की स्थिति) और उच्च ऊर्जा की एक उत्तेजित इलेक्ट्रॉनिक स्थिति होती है। इनमें से प्रत्येक इलेक्ट्रॉनिक अवस्था के अंदर विभिन्न कंपन अवस्थाएँ होती हैं। [1]

फ्लोरोसेंस में, प्रजाति सबसे पहले उत्तेजित होती है, एक फोटॉन को अवशोषित करके, इसकी समतल इलेक्ट्रॉनिक अवस्था से उत्तेजित इलेक्ट्रॉनिक अवस्था में विभिन्न कंपन अवस्थाओं में से एक में है। अन्य अणुओं के साथ टकराव उत्तेजित अणु को कंपन ऊर्जा खोने का कारण बनता है जब तक कि यह उत्साहित इलेक्ट्रॉनिक स्थिति से निम्नतम कंपन स्थिति तक नहीं पहुंच जाता है। इस प्रक्रिया को प्रायः जब्लोन्स्की आरेख के साथ देखा जाता है।[1]

अणु फिर समतल इलेक्ट्रॉनिक स्थिति के विभिन्न कंपन स्तरों में से एक में गिर जाता है, इस प्रक्रिया में एक फोटॉन का उत्सर्जन होता है। [1] जैसा कि अणु समतल अवस्था में कई कंपन स्तरों में नीचे गिर सकते हैं, उत्सर्जित फोटॉनों में अलग-अलग ऊर्जाएं होंगी, और इस प्रकार आवृत्तियां होंगी। इसलिए, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी में उत्सर्जित प्रकाश की विभिन्न आवृत्तियों का विश्लेषण करके उनकी सापेक्ष तीव्रता के साथ, विभिन्न कंपन स्तरों की संरचना निर्धारित की जा सकती है।

परमाणु प्रजातियों के लिए, प्रक्रिया समान है; चूंकि परमाणु प्रजातियों में कंपन ऊर्जा का स्तर नहीं होता है, उत्सर्जित फोटॉन प्रायः घटना विकिरण के समान तरंग दैर्ध्य पर होते हैं। अवशोषित फोटॉन को फिर से उत्सर्जित करने की यह प्रक्रिया प्रतिध्वनि प्रतिदीप्ति है और जबकि यह परमाणु प्रतिदीप्ति की विशेषता है, आणविक प्रतिदीप्ति में भी देखी जाती है।[2]

एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति (उत्सर्जन) माप में, उत्तेजना तरंगदैर्घ्य निश्चित होता है और पता लगाने की तरंग दैर्ध्य भिन्न होती है, जबकि एक प्रतिदीप्ति उत्तेजना माप में पता लगाने की तरंग दैर्ध्य तय होती है और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ब्याज के क्षेत्र में भिन्न होता है। एक उत्सर्जन मानचित्र को उत्तेजन तरंगदैर्घ्य की एक श्रृंखला से उत्पन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को सूची करके और उन सभी को एक साथ जोड़कर मापा जाता है। यह एक तीन आयामी सतह डेटा समूह है: उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक कार्य के रूप में उत्सर्जन की तीव्रता और सामान्यतः एक समोच्च मानचित्र के रूप में दर्शाया गया है।

उपकरण

दो सामान्य प्रकार के उपकरण उपस्थित हैं: प्रकीर्णन फ्लोरोमीटर जो विक्षनरी को अलग करने के लिए प्रकीर्णन का उपयोग करते हैं: घटना प्रकाश और प्रतिदीप्ति प्रकाश और स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर जो घटना प्रकाश और फ्लोरोसेंट प्रकाश को अलग करने के लिए विवर्तन सख्त मोनोक्रोमेटर का उपयोग करते हैं।

दोनों प्रकार निम्नलिखित योजना का उपयोग करते हैं: एक उत्तेजना स्रोत से प्रकाश एक प्रकीर्णन या मोनोक्रोमेटर से होकर गुजरता है, और नमूने पर प्रहार करता है। आपतित प्रकाश का एक अनुपात नमूने द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है, और नमूने के कुछ अणु प्रतिदीप्त हो जाते हैं। फ्लोरोसेंट प्रकाश सभी दिशाओं में उत्सर्जित होती है। इस फ्लोरोसेंट प्रकाश में से कुछ एक दूसरे प्रकीर्णन या मोनोक्रोमेटर के माध्यम से गुजरता है और एक संसूचक तक पहुंचता है, जो सामान्यतः संचरित या परावर्तित घटना प्रकाश के संसूचक तक पहुंचने के कठिन परिस्थिति को कम करने के लिए घटना प्रकाश किरण के 90 डिग्री पर रखा जाता है।

फ्लोरीमीटर के घटकों का एक सरल डिजाइन

विभिन्न प्रकाश स्रोतों का उपयोग उत्तेजना स्रोतों के रूप में किया जा सकता है, जिसमें लेजर, एलईडी और लैंप सम्मिलित हैं; क्सीनन चाप लैंप और विशेष रूप से पारा-वाष्प लैंप एक लेज़र बहुत संकीर्ण तरंग दैर्ध्य अंतराल पर, सामान्यतः 0.01 एनएम के तहत केवल उच्च विकिरण का प्रकाश उत्सर्जित करता है, जो एक उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन को अनावश्यक बनाता है। इस पद्धति का हानि यह है कि लेजर की तरंग दैर्ध्य को ज्यादा नहीं बदला जा सकता है। एक मरकरी वेपर लैम्प एक लाइन लैम्प है, जिसका अर्थ है कि यह अधिकतम तरंगदैर्घ्य के निकट प्रकाश उत्सर्जित करता है। इसके विपरीत, एक क्सीनन चाप में 300-800 एनएम की सीमा में लगभग निरंतर तीव्रता वाला एक निरंतर उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है और माप के लिए पर्याप्त विकिरण 200 एनएम से थोड़ा ऊपर होता है।

फ्लोरीमीटर में प्रकीर्णन और/या मोनोक्रोमेटर्स का उपयोग किया जा सकता है। एक मोनोक्रोमेटर एक समायोज्य सहिष्णुता के साथ एक समायोज्य तरंग दैर्ध्य का प्रकाश प्रसारित करता है। मोनोक्रोमेटर का सबसे सामान्य प्रकार एक विवर्तन सख्त का उपयोग करता है, अर्थात, संपार्श्विक प्रकाश एक सख्त को प्रकाशित करता है और तरंग दैर्ध्य के आधार पर एक अलग कोण से बाहर निकलता है। तब मोनोक्रोमेटर को यह चुनने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि किस तरंगदैर्घ्य को संचारित करना है। अनिसोट्रॉपी माप की अनुमति देने के लिए दो ध्रुवीकरण प्रकीर्णन को जोड़ना आवश्यक है: एक उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन के बाद, और एक उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन से पहले है ।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रतिदीप्ति को प्रायः उत्तेजना प्रकाश के सापेक्ष 90 डिग्री के कोण पर मापा जाता है। संचरित उत्तेजना प्रकाश के हस्तक्षेप से बचने के लिए 180 डिग्री कोण पर उत्तेजना प्रकाश की रेखा पर सेंसर रखने के अतिरिक्त इस ज्यामिति का उपयोग किया जाता है। कोई मोनोक्रोमेटर सही नहीं है और यह कुछ निकले हुए प्रकाश को प्रसारित करेगा, जिससे लक्षित की तुलना में अन्य तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश एक आदर्श मोनोक्रोमेटर केवल निर्दिष्ट सीमा में प्रकाश संचारित करेगा और एक उच्च तरंग दैर्ध्य-स्वतंत्र संचरण होगा। 90° के कोण पर मापते समय, केवल नमूने द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश ही आवारा प्रकाश का कारण बनता है। इसका परिणाम बेहतर ध्वनि -से -संकेत अनुपात में होता है, और पता लगाने की सीमा लगभग 10000 तक कम हो जाती है,[3] 180° ज्यामिति की तुलना में। इसके अतिरिक्त , प्रतिदीप्ति को सामने से भी मापा जा सकता है, जो प्रायः टर्बिड या अपारदर्शी नमूनों के लिए किया जाता है

.[4]

संसूचक या तो एकल -चैनल या बहु चैनल हो सकता है। एकल-चैनल वाला संसूचक एक समय में केवल एक तरंग दैर्ध्य की तीव्रता का पता लगा सकता है, जबकि बहु-चैनल वाला एक साथ सभी तरंग दैर्ध्य की तीव्रता का पता लगाता है, जिससे उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन अनावश्यक हो जाता है।

दोहरे मोनोक्रोमेटर्स और एक सतत उत्तेजना प्रकाश स्रोत के साथ सबसे बहुमुखी फ्लोरीमीटर एक उत्तेजना स्पेक्ट्रम और एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम दोनों को सूची कर सकते हैं। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा को मापते समय उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को स्थिर रखा जाता है, अधिमानतः उच्च अवशोषण की तरंग दैर्ध्य पर और उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर स्पेक्ट्रम को स्कैन करता है। उत्तेजना स्पेक्ट्रा को मापने के लिए उत्सर्जन प्रकीर्णन या मोनोक्रोमेटर से गुजरने वाली तरंग दैर्ध्य को स्थिर रखा जाता है और उत्तेजना मोनोक्रोमेटर स्कैन कर रहा है। उत्तेजना स्पेक्ट्रम सामान्यतः अवशोषण स्पेक्ट्रम के समान होता है क्योंकि प्रतिदीप्ति तीव्रता अवशोषण के समानुपाती होती है।[5]

डेटा का विश्लेषण

OpenChrom से GNU R निर्यात
पदार्थ मिलान दिखाने वाले OpenChrom में OpenFluor प्लगइन[6]

कम सांद्रता पर प्रतिदीप्ति तीव्रता (भौतिकी) सामान्यतः फ्लोरोफोरे की सांद्रता के समानुपाती होगी।

यूवी/दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी के विपरीत, 'मानक', उपकरण स्वतंत्र स्पेक्ट्रा आसानी से प्राप्त नहीं होते हैं। कई कारक स्पेक्ट्रा को प्रभावित और विकृत करते हैं, और 'सही', जिससे मशीन-स्वतंत्र, स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए सुधार आवश्यक हैं। विभिन्न प्रकार की विकृतियों को यहाँ या तो उपकरण- या नमूना-संबंधी होने के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा। सर्वप्रथम यंत्र से उत्पन्न विकृति की चर्चा की जाती है। प्रारंभ के रूप में, प्रत्येक प्रयोग के समय और प्रत्येक प्रयोग के बीच समय के साथ प्रकाश स्रोत की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य विशेषताएँ बदलती रहती हैं। इसके अतिरिक्त , किसी भी लैंप की तीव्रता सभी तरंग दैर्ध्य पर स्थिर नहीं होती है। इसे ठीक करने के लिए प्रकाश के एक भाग को संदर्भ संसूचक पर निर्देशित करने के लिए उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन के बाद एक बीम विभाजक लगाया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, मोनोक्रोमेटर्स और प्रकीर्णन की संचरण दक्षता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। समय के साथ इनमें बदलाव भी हो सकता है। मोनोक्रोमेटर की संचरण क्षमता भी तरंग दैर्ध्य के आधार पर भिन्न होती है। यही कारण है कि उत्तेजना मोनोक्रोमेटर या प्रकीर्णन के बाद एक वैकल्पिक संदर्भ संसूचक रखा जाना चाहिए। संसूचक द्वारा उठाए गए फ्लोरोसेंस का प्रतिशत भी प्रणाली पर निर्भर है। इसके अतिरिक्त , संसूचक क्वांटम दक्षता, जिससे पता लगाए गए फोटॉनों का प्रतिशत, अलग-अलग संसूचको के बीच, तरंग दैर्ध्य और समय के साथ भिन्न होता है, क्योंकि संसूचक अनिवार्य रूप से अशक्त होता है ।

जिन दो अन्य विषयों पर विचार किया जाना चाहिए, उनमें विकिरण को निर्देशित करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रकाशिकी और नमूना पदार्थ को धारण करने या रखने के साधन (क्युवेट या सेल कहा जाता है) सम्मिलित हैं। अधिकांश यूवी, दृश्यमान और एनआईआर मापों के लिए स्पष्ट क्वार्ट्ज क्यूवेट्स का उपयोग आवश्यक है। दोनों ही स्थिति में, उन पदार्थ का चयन करना महत्वपूर्ण है जिनका ब्याज की तरंग दैर्ध्य सीमा में अपेक्षाकृत कम अवशोषण होता है। क्वार्ट्ज आदर्श है क्योंकि यह 200 एनएम-2500 एनएम से प्रसारित होता है; उच्च ग्रेड क्वार्ट्ज भी 3500 एनएम तक संचारित कर सकता है, जबकि अन्य पदार्थ के अवशोषण गुण नमूने से फ्लोरेसेंस को आवरण कर सकते हैं।

एक 'मानक' स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए इन सभी सहायक कारकों में सुधार एक थकाऊ प्रक्रिया है, जिसे व्यवहार में तभी प्रयुक्त किया जाता है जब यह अत्यंत आवश्यक हो। क्वांटम उपज को मापने या उदाहरण के लिए उच्चतम उत्सर्जन तीव्रता के साथ तरंग दैर्ध्य खोजने पर यह स्थिति है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नमूने से भी विकृतियाँ उत्पन्न होती हैं। इसलिए, नमूने के कुछ पहलुओं को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, फोटोडिकम्पोजिशन समय के साथ प्रतिदीप्ति की तीव्रता को कम कर सकता है। प्रकाश के प्रकीर्णन को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस संदर्भ में सबसे महत्वपूर्ण प्रकार के प्रकीर्णन रेले और रमन प्रकीर्णन हैं। रमन प्रकीर्णन द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य आपतित प्रकाश के समान होती है, जबकि रमन प्रकीर्णन में प्रकीर्णित प्रकाश तरंग दैर्ध्य को सामान्यतः लंबी तरंग दैर्ध्य में बदल देता है। रमन प्रकीर्णन उत्तेजना प्रकाश द्वारा प्रेरित एक आभासी इलेक्ट्रॉनिक स्थिति का परिणाम है। इस आभासी स्थिति (भौतिकी) स्टेट के अतिरिक्त किसी कंपन स्तर पर आराम कर सकते हैं।[7] प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में, यह हमेशा उत्तेजना तरंग संख्या के सापेक्ष एक स्थिर तरंग संख्या अंतर पर देखा जाता है उदा। तरंग संख्या में उत्तेजना प्रकाश की तुलना में 3600 सेमी-1 कम तरंग संख्या पर दिखाई देती है।

अन्य पहलुओं पर विचार करने के लिए आंतरिक प्रकीर्णन प्रभाव हैं।[8][9] इनमें पुन: अवशोषण सम्मिलित है। पुनर्अवशोषण इसलिए होता है क्योंकि एक अन्य अणु या मैक्रोमोलेक्यूल का भाग तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित होता है जिस पर फ्लोरोफोर विकिरण उत्सर्जित करता है। यदि यह स्थिति है, तो फ़्लोरोफ़ोर द्वारा उत्सर्जित कुछ या सभी फोटॉनों को फिर से अवशोषित किया जा सकता है। एक अन्य आंतरिक प्रकीर्णन प्रभाव फ्लोरोफोर सहित अवशोषित अणुओं की उच्च सांद्रता के कारण होता है। इसका परिणाम यह होता है कि उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता पूरे समाधान में स्थिर नहीं होती है। नतीजतन, उत्तेजना प्रकाश का केवल एक छोटा प्रतिशत फ्लोरोफोरस तक पहुंचता है जो पहचान प्रणाली के लिए दिखाई दे रहे हैं। आंतरिक प्रकीर्णन प्रभाव उत्सर्जित प्रकाश के स्पेक्ट्रम और तीव्रता को बदलते हैं और इसलिए फ्लोरोसेंट प्रकाश के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करते समय उन पर विचार किया जाना चाहिए।[5][10]

इसलिए फ्लोरोसेंट प्रकाश के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करते समय उन पर विचार किया जाना चाहिए।[5]

ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति

मुड़े हुए प्रोटीन का प्रतिदीप्ति व्यक्तिगत सुगंधित अवशेषों से प्रतिदीप्ति का मिश्रण है। मुड़े हुए प्रोटीन के अधिकांश आंतरिक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन ट्रिप्टोफैन अवशेषों के उत्तेजना के कारण होते हैं, कुछ उत्सर्जन टायरोसिन और फेनिलएलनिन के कारण होते हैं; किंतु इस तरंग दैर्ध्य रेंज में डाइसल्फ़ाइड बांडों का भी प्रशंसनीय अवशोषण होता है। सामान्यतः , ट्रिप्टोफैन में 280 एनएम के अधिकतम अवशोषण की तरंग दैर्ध्य और एक उत्सर्जन शिखर होता है जो सॉल्वैटोक्रोमिक होता है, सीए से लेकर। स्थानीय वातावरण की ध्रुवीयता के आधार पर 300 से 350 एनएम [11] इसलिए, प्रोटीन प्रतिदीप्ति का उपयोग प्रोटीन के संचलन की स्थिति के निदान के रूप में किया जा सकता है।[12] इसके अतिरिक्त , ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति अन्य अवशेषों की निकटता से दृढ़ता से प्रभावित होती है (यानी, एस्प या ग्लू जैसे आस-पास के प्रोटोनेटेड समूह ट्रैप प्रतिदीप्ति के शमन (प्रतिदीप्ति) का कारण बन सकते हैं)। इसके अतिरिक्त , ट्रिप्टोफैन और अन्य फ्लोरोसेंट अमीनो एसिड के बीच ऊर्जा हस्तांतरण संभव है, जो विश्लेषण को प्रभावित करेगा, खासकर उन स्थिति में जहां फोर्स्टर अम्लीय दृष्टिकोण लिया जाता है। इसके अतिरिक्त , ट्रिप्टोफैन एक अपेक्षाकृत दुर्लभ अमीनो एसिड है; कई प्रोटीनों में केवल एक या कुछ ट्रिप्टोफैन अवशेष होते हैं। इसलिए, ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति अलग-अलग ट्रिप्टोफैन अवशेषों के संचलन की स्थिति का एक बहुत ही संवेदनशील माप हो सकता है। बाह्य जांच की तुलना में लाभ यह है कि प्रोटीन स्वयं परिवर्तित नहीं होता है। प्रोटीन रचना के अध्ययन के लिए आंतरिक प्रतिदीप्ति का उपयोग कुछ (या शायद केवल एक) ट्रिप्टोफैन अवशेषों के स्थिति तक सीमित है, क्योंकि प्रत्येक एक अलग स्थानीय वातावरण का अनुभव करता है, जो विभिन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को जन्म देता है।

ट्रिप्टोफैन एक महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरोसेंट (एमिनो एसिड) है, जिसका उपयोग ट्रिप्टोफैन के माइक्रोएन्वायरमेंट की प्रकृति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। डिनेचुरेंट्स, पृष्ठसक्रियकारक ्स या अन्य amphiphilic अणुओं के साथ प्रयोग करते समय, ट्रिप्टोफैन का माइक्रोएन्वायरमेंट बदल सकता है। उदाहरण के लिए, यदि इसके 'हाइड्रोफोबिक' कोर में एकल ट्रिप्टोफैन युक्त प्रोटीन को बढ़ते तापमान के साथ विकृत किया जाता है, तो एक लाल-स्थानांतरित उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दिखाई देगा। यह हाइड्रोफोबिक प्रोटीन इंटीरियर के विपरीत एक जलीय वातावरण में ट्रिप्टोफैन के संपर्क के कारण होता है। इसके विपरीत, एक प्रोटीन के लिए एक सर्फेक्टेंट के अतिरिक्त जिसमें एक ट्रिप्टोफैन होता है जो जलीय विलायक के संपर्क में आता है, यदि ट्रिप्टोफैन सर्फेक्टेंट वेसिकल (जीव विज्ञान) या मिसेल में एम्बेडेड होता है, तो एक ब्लू-शिफ्ट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का कारण होगा।[13] ट्रिप्टोफैन की कमी वाले प्रोटीन को फ्लोरोफोर से जोड़ा जा सकता है।

295 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्तेजना के साथ, ट्रिप्टोफैन उत्सर्जन स्पेक्ट्रम कमजोर टायरोसिन और फेनिलएलनिन प्रतिदीप्ति पर हावी है।

अनुप्रयोग

फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कार्बनिक यौगिकों के विश्लेषण के लिए जैव रासायनिक, चिकित्सा और रासायनिक अनुसंधान क्षेत्रों में किया जाता है। घातक त्वचा ट्यूमर को सौम्य से अलग करने में इसके उपयोग की एक रिपोर्ट भी आई है।

परमाणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएस) विधि हवा या पानी, या अन्य मीडिया में उपस्थित यौगिक के अन्य प्रकार के विश्लेषण/माप में उपयोगी होती है, जैसे सीवीएएफएस जिसका उपयोग पारा जैसे भारी धातुओं का पता लगाने के लिए किया जाता है।

प्रतिदीप्ति का उपयोग फोटॉनों को पुनर्निर्देशित करने के लिए भी किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट सौर संग्राहक देखें।

इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी को माइक्रोफ्लोरोमेट्री का उपयोग करके सूक्ष्म स्तर पर अनुकूलित किया जा सकता है

विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में, एचपीएलसी के साथ प्रतिदीप्ति संसूचको का उपयोग किया जाता है।

जल अनुसंधान के क्षेत्र में, जैविक प्रदूषकों का पता लगाकर पानी की गुणवत्ता की निगरानी के लिए प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।[14] कंप्यूटर विज्ञान और मशीन लर्निंग में हालिया प्रगति ने पानी के जीवाणु संदूषण का पता लगाने में भी सक्षम बनाया है [15]

यह भी देखें

संदर्भ

  1. ↑ 1.0 1.1 1.2 Animation for the principle of fluorescence and UV-visible absorbance
  2. ↑ Principles Of Instrumental Analysis F.James Holler, Douglas A. Skoog & Stanley R. Crouch 2006
  3. ↑ Rendell, D. (1987). Fluorescence and Phosphorescence. Crown
  4. ↑ Eisinger, Josef; Flores, Jorge (1979). "तरल नमूनों का फ्रंट-फेस फ्लोरोमेट्री". Analytical Biochemistry. 94 (1): 15–21. doi:10.1016/0003-2697(79)90783-8. ISSN 0003-2697. PMID 464277.
  5. ↑ 5.0 5.1 5.2 Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21 May 1999). प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का परिचय. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.
  6. ↑ Murphy, Kathleen R.; Stedmon, Colin A.; Wenig, Philip; Bro, Rasmus (2014). "OpenFluor– an online spectral library of auto-fluorescence by organic compounds in the environment" (PDF). Anal. Methods. 6 (3): 658–661. doi:10.1039/C3AY41935E.
  7. ↑ Gauglitz, G. and Vo-Dinh, T. (2003). Handbook of spectroscopy. Wiley-VCH.
  8. ↑ Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Ceresa, Luca; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Szabelski, Mariusz; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2020-06-01). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence Part I: primary inner filter effect-the proper approach for sample absorbance correction". Methods and Applications in Fluorescence. 8 (3): 033002. Bibcode:2020MApFl...8c3002K. doi:10.1088/2050-6120/ab947c. ISSN 2050-6120. PMID 32428893. S2CID 218758981.
  9. ↑ Ceresa, Luca; Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2021-05-24). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence. Part II: secondary inner filter effect -the proper use of front-face configuration for highly absorbing and scattering samples". Methods and Applications in Fluorescence. 9 (3): 035005. Bibcode:2021MApFl...9c5005C. doi:10.1088/2050-6120/ac0243. ISSN 2050-6120. PMID 34032610. S2CID 235201243.
  10. ↑ Lakowicz, J. R. (1999). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic / Plenum Publishers
  11. ↑ Intrinsic Fluorescence of Proteins and Peptides Archived 2010-05-16 at the Wayback Machine
  12. ↑ Vivian JT, Callis PR (2001). "ट्रिप्टोफैन प्रतिदीप्ति के तंत्र प्रोटीन में बदल जाते हैं". Biophys. J. 80 (5): 2093–109. Bibcode:2001BpJ....80.2093V. doi:10.1016/S0006-3495(01)76183-8. PMC 1301402. PMID 11325713. Archived from the original on September 6, 2008.
  13. ↑ Caputo GA, London E. Cumulative effects of amino acid substitutions and hydrophobic mismatch upon the transmembrane stability and conformation of hydrophobic alpha-helices. Biochemistry. 2003 Mar 25;42(11):3275-85.
  14. ↑ Carstea, Elfrida M.; Bridgeman, John; Baker, Andy; Reynolds, Darren M. (2016-05-15). "Fluorescence spectroscopy for wastewater monitoring: A review". Water Research (in English). 95: 205–219. doi:10.1016/j.watres.2016.03.021. ISSN 0043-1354. PMID 26999254. S2CID 205696150.
  15. ↑ Nakar, Amir; Schmilovitch, Ze’ev; Vaizel-Ohayon, Dalit; Kroupitski, Yulia; Borisover, Mikhail; Sela (Saldinger), Shlomo (2020-02-01). "प्रतिदीप्ति और उत्तेजना-उत्सर्जन मैट्रिसेस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के पीएलएस विश्लेषण का उपयोग करके पानी में बैक्टीरिया की मात्रा". Water Research (in English). 169: 115197. doi:10.1016/j.watres.2019.115197. ISSN 0043-1354. PMID 31670087. S2CID 204967767.


बाहरी संबंध

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