आकार अपवर्जन वर्णलेखन

आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), जिसे आणविक छलनी क्रोमैटोग्राफी के रूप में भी जाना जाता है, एक क्रोमैटोग्राफी विधि है जिसमें समाधान (रसायन विज्ञान) में अणुओं को उनके आकार और कुछ मामलों में आणविक भार से अलग किया जाता है। यह आमतौर पर बड़े अणुओं या मैक्रो मोलेक्यूल र कॉम्प्लेक्स जैसे प्रोटीन और औद्योगिक पॉलिमर पर लागू होता है। आमतौर पर, जब एक जलीय घोल का उपयोग स्तंभ के माध्यम से नमूने को ले जाने के लिए किया जाता है, तो तकनीक को जेल-निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के रूप में जाना जाता है, बनाम नाम जेल पर्मिएशन क्रोमेटोग्राफी, जिसका उपयोग तब किया जाता है जब एक कार्बनिक विलायक को मोबाइल चरण के रूप में उपयोग किया जाता है। क्रोमैटोग्राफी कॉलम महीन, झरझरा मोतियों से भरा होता है जो आमतौर पर  dextran, एगारोस या  polyacrylamide  पॉलिमर से बना होता है। मैक्रोमोलेक्यूल के आयामों का अनुमान लगाने के लिए इन मोतियों के छिद्रों के आकार का उपयोग किया जाता है। SEC एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला बहुलक लक्षण वर्णन विधि है, क्योंकि इसकी पॉलिमर के लिए अच्छे दाढ़ द्रव्यमान वितरण (Mw) परिणाम प्रदान करने की क्षमता है।

अनुप्रयोग
आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का मुख्य अनुप्रयोग प्रोटीन और अन्य पानी में घुलनशील पॉलिमर का विभाजन है, जबकि जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कार्बनिक-घुलनशील पॉलिमर के आणविक भार वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। किसी भी तकनीक को जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए, जहां एक विद्युत क्षेत्र का उपयोग अणुओं को उनके विद्युत आवेशों के आधार पर जेल के माध्यम से खींचने के लिए किया जाता है। किसी छिद्र के भीतर विलेय के रहने की मात्रा, छिद्र के आकार पर निर्भर करती है। बड़े विलेय की एक छोटी मात्रा तक पहुंच होगी और इसके विपरीत। इसलिए, बड़े विलेय की तुलना में एक छोटा विलेय लंबे समय तक छिद्र के भीतर रहेगा। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का एक अन्य उपयोग पानी में प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ की स्थिरता और विशेषताओं की जांच करना है। <रेफरी नाम = मुलर 4867-4872>{{cite journal | vauthors = Müller MB, Schmitt D, Frimmel FH |date=1 Dec 2000|title=आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी-गुणों और अंशों की स्थिरता द्वारा प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ का फ्रैक्शनेशन|journal=Environ Sci Technol |volume=34 |issue=23 |pages=4867–4872 |bibcode=2000EnST...34.4867M |doi=10.1021/es000076v } इस पद्धति में, मार्गिट बी. मुलर, डैनियल श्मिट, और फ्रिट्ज़ एच. फ्रिमेल ने दुनिया के विभिन्न स्थानों से पानी के स्रोतों का परीक्षण किया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ समय के साथ कितना स्थिर है। <रेफरी नाम= मुलर 4867–4872 /> भले ही प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थों का अध्ययन करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, इसकी सीमाएँ हैं। इन सीमाओं में से एक में यह शामिल है कि कोई मानक आणविक भार मार्कर नहीं है; यदि सटीक आणविक भार की आवश्यकता होती है, तो अन्य विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए।

लाभ
इस पद्धति के फायदों में छोटे अणुओं से बड़े अणुओं का अच्छा पृथक्करण शामिल है, जिसमें न्यूनतम आयतन होता है, और विभिन्न समाधानों को निस्पंदन प्रक्रिया में हस्तक्षेप किए बिना लागू किया जा सकता है, सभी कणों की जैविक गतिविधि को अलग करने के लिए संरक्षित करते हुए। तकनीक आम तौर पर दूसरों के साथ संयुक्त होती है जो कुछ यौगिकों के लिए अम्लता, मूलता, आवेश और आत्मीयता जैसी अन्य विशेषताओं द्वारा अणुओं को अलग करती है। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के साथ, कम और अच्छी तरह से परिभाषित पृथक्करण समय और संकीर्ण बैंड होते हैं, जिससे अच्छी संवेदनशीलता होती है। कोई नमूना हानि भी नहीं है क्योंकि विलेय स्थिर चरण के साथ परस्पर क्रिया नहीं करते हैं।

इस प्रायोगिक विधि का अन्य लाभ यह है कि कुछ मामलों में, यौगिक के अनुमानित आणविक भार को निर्धारित करना संभव है। यौगिक (एलुएंट) का आकार और आकार यह निर्धारित करता है कि यौगिक जेल (स्थिर चरण) के साथ कैसे संपर्क करता है। अनुमानित आणविक भार निर्धारित करने के लिए, उनके संबंधित आणविक भार वाले यौगिकों के रेफरेंस वॉल्यूम प्राप्त किए जाते हैं और फिर "के" का एक प्लॉटav"बनाम" लॉग (मेगावाट)" बनाया गया है, जहां $$K_{av} = (V_e-V_o)/(V_t-V_o)$$और Mw आणविक द्रव्यमान है। यह प्लॉट अंशांकन वक्र के रूप में कार्य करता है, जिसका उपयोग वांछित यौगिक के आणविक भार को अनुमानित करने के लिए किया जाता है। वीe घटक उस आयतन का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर मध्यवर्ती अणु इलूट करते हैं जैसे अणु जिनकी स्तंभ के मनकों तक आंशिक पहुंच होती है। इसके अलावा, वीt मनकों के बीच के कुल आयतन और मनकों के भीतर के आयतन का योग होता है। वीo घटक उस मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर बड़े अणु एल्यूट करते हैं, जो शुरुआत में एल्यूट होता है। नुकसान हैं, उदाहरण के लिए, केवल एक सीमित संख्या में बैंड को समायोजित किया जा सकता है क्योंकि क्रोमेटोग्राम का समय स्केल छोटा है, और सामान्य तौर पर, एक अच्छा संकल्प प्राप्त करने के लिए आणविक द्रव्यमान में 10% अंतर होना चाहिए।

डिस्कवरी
इस तकनीक का आविष्कार 1955 में ग्रांट हेनरी लेथ और कॉलिन आर रूथवेन द्वारा किया गया था, जो क्वीन चार्लोट्स हॉस्पिटल, लंदन में काम कर रहे थे। इस आविष्कार के लिए उन्हें बाद में जॉन स्कॉट पुरस्कार मिला। जबकि लेथ और रूथवेन ने मैट्रिक्स के रूप में स्टार्च जैल का इस्तेमाल किया, जर्कर पोरथ और  प्रति फ्लोडिन  ने बाद में डेक्सट्रान जैल पेश किया; आकार के विभाजन गुणों वाले अन्य जैल में agarose और polyacrylamide शामिल हैं। इन घटनाक्रमों की एक संक्षिप्त समीक्षा सामने आई है। सिंथेटिक उच्च पॉलिमर को अलग करने का भी प्रयास किया गया; हालांकि, यह 1964 तक नहीं था, जब डॉव केमिकल कंपनी के जे.सी. मूर ने नियंत्रित ताकना आकार के साथ क्रॉस-लिंक्ड POLYSTYRENE पर आधारित जेल परमिट क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) कॉलम की तैयारी पर अपना काम प्रकाशित किया था, कि इस क्षेत्र में अनुसंधान गतिविधियों में तेजी से वृद्धि शुरू हुई। यह लगभग तुरंत पहचाना गया कि उचित अंशांकन के साथ, GPC सिंथेटिक पॉलिमर के लिए दाढ़ द्रव्यमान और दाढ़ द्रव्यमान वितरण जानकारी प्रदान करने में सक्षम था। क्योंकि बाद की जानकारी अन्य तरीकों से प्राप्त करना कठिन था, जीपीसी तेजी से व्यापक उपयोग में आया।

सिद्धांत और विधि
एसईसी मुख्य रूप से प्रोटीन या पॉलिमर जैसे बड़े अणुओं के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। SEC adsorbent (स्थिर चरण) के छिद्रों में छोटे अणुओं को फँसाने का काम करता है। यह प्रक्रिया आमतौर पर एक स्तंभ के भीतर की जाती है, जिसमें आमतौर पर एक खोखली ट्यूब होती है जो माइक्रोन-स्केल पॉलीमर मोतियों से भरी होती है जिसमें विभिन्न आकारों के छिद्र होते हैं। ये छिद्र मनका के माध्यम से सतह या चैनलों पर अवसाद हो सकते हैं। जैसे ही समाधान स्तंभ के नीचे जाता है, कुछ कण छिद्रों में प्रवेश कर जाते हैं। बड़े कण इतने छिद्रों में प्रवेश नहीं कर सकते। कण जितने बड़े होंगे, रेफरेंस उतना ही तेज होगा। बड़े अणु केवल छिद्रों से गुजरते हैं क्योंकि वे अणु छिद्रों में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े होते हैं। इसलिए बड़े अणु छोटे अणुओं की तुलना में अधिक तेज़ी से स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित होते हैं, अर्थात अणु जितना छोटा होता है, अवधारण समय उतना ही अधिक होता है।

एसईसी के लिए एक आवश्यकता यह है कि विश्लेषण स्थिर चरणों की सतह के साथ बातचीत नहीं करता है, विश्लेषणों के बीच क्षालन समय में अंतर के साथ आदर्श रूप से विलेय मात्रा पर आधारित होता है, जो स्थिर चरणों के साथ रासायनिक या इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के बजाय विश्लेषिकी में प्रवेश कर सकता है। इस प्रकार, एक छोटा अणु जो स्थिर चरण ताकना प्रणाली के प्रत्येक क्षेत्र में प्रवेश कर सकता है, पूरे ताकना मात्रा और इंटरपार्टिकल वॉल्यूम के योग के बराबर कुल मात्रा में प्रवेश कर सकता है। यह छोटा अणु देर से निकलता है (अणु के सभी छिद्र- और इंटरपार्टिकल वॉल्यूम में प्रवेश करने के बाद - कॉलम वॉल्यूम का लगभग 80%)। दूसरे चरम पर, एक बहुत बड़ा अणु जो किसी भी छोटे छिद्रों में प्रवेश नहीं कर सकता है, केवल इंटरपार्टिकल वॉल्यूम (कॉलम वॉल्यूम का ~ 35%) में प्रवेश कर सकता है और जब मोबाइल चरण की यह मात्रा कॉलम के माध्यम से पारित हो जाती है तो इससे पहले एल्यूट हो जाता है। एसईसी का अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि विभिन्न आकारों के कण अलग-अलग दरों पर एक स्थिर चरण के माध्यम से रेफरेंस (फ़िल्टर) करते हैं। इसके परिणामस्वरूप आकार के आधार पर कणों का विलयन अलग हो जाता है। बशर्ते कि सभी कणों को एक साथ या लगभग एक साथ लोड किया जाए, एक ही आकार के कणों को एक साथ निस्तारण करना चाहिए।

हालाँकि, चूंकि एक मैक्रोमोलेक्यूल के आकार के विभिन्न उपाय हैं (उदाहरण के लिए, परिभ्रमण की त्रिज्या और हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या), SEC के सिद्धांत में एक मूलभूत समस्या एक उचित आणविक आकार के पैरामीटर का विकल्प है जिसके द्वारा अलग-अलग अणु प्रकार अलग किये जाते हैं। प्रायोगिक तौर पर, बेनोइट और सहकर्मियों ने कई अलग-अलग श्रृंखला वास्तुकला और रासायनिक रचनाओं के लिए रेफरेंस वॉल्यूम और गतिशील रूप से आधारित आणविक आकार, हाइड्रोडायनामिक मात्रा के बीच एक उत्कृष्ट सहसंबंध पाया। हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम के आधार पर मनाया गया सहसंबंध सार्वभौमिक एसईसी अंशांकन के आधार के रूप में स्वीकार किया गया।

फिर भी, SEC डेटा की व्याख्या में हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम, डायनेमिक गुणों पर आधारित आकार का उपयोग पूरी तरह से समझा नहीं गया है। ऐसा इसलिए है क्योंकि एसईसी आमतौर पर कम प्रवाह दर की स्थिति में चलाया जाता है जहां हाइड्रोडायनामिक कारक का पृथक्करण पर बहुत कम प्रभाव होना चाहिए। वास्तव में, सिद्धांत और कंप्यूटर सिमुलेशन दोनों एक थर्मोडायनामिक पृथक्करण सिद्धांत मानते हैं: पृथक्करण प्रक्रिया दो चरणों के बीच विलेय मैक्रोमोलेक्यूल्स के संतुलन वितरण (विभाजन) द्वारा निर्धारित की जाती है: अंतरालीय स्थान पर स्थित एक पतला थोक समाधान चरण और छिद्रों के भीतर सीमित समाधान चरण। स्तंभ पैकिंग सामग्री की। इस सिद्धांत के आधार पर, यह दिखाया गया है कि छिद्रों में पॉलिमर के विभाजन के लिए प्रासंगिक आकार पैरामीटर औसत अवधि आयाम है (मतलब एक रेखा पर अधिकतम प्रक्षेपण)। हालांकि इस मुद्दे को पूरी तरह से हल नहीं किया गया है, यह संभावना है कि माध्य अवधि आयाम और हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम दृढ़ता से सहसंबद्ध हैं। प्रत्येक आकार बहिष्करण स्तंभ में आणविक भार की एक सीमा होती है जिसे अलग किया जा सकता है। बहिष्करण सीमा स्तंभ 'वर्किंग' रेंज के ऊपरी छोर पर आणविक भार को परिभाषित करती है और जहां स्थिर चरण में फंसने के लिए अणु बहुत बड़े होते हैं। सीमा के निचले सिरे को पारगम्यता सीमा द्वारा परिभाषित किया गया है, जो एक अणु के आणविक भार को परिभाषित करता है जो कि स्थिर चरण के सभी छिद्रों में प्रवेश करने के लिए काफी छोटा है। इस आणविक द्रव्यमान के नीचे के सभी अणु इतने छोटे होते हैं कि वे एक बैंड के रूप में एल्यूट करते हैं।

फ़िल्टर किए गए समाधान को अंत में एकत्र किया जाता है जिसे एल्यूएट के रूप में जाना जाता है। शून्य आयतन में माध्यम में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े कण शामिल हैं, और विलायक आयतन को स्तंभ आयतन के रूप में जाना जाता है।

निम्नलिखित सामग्रियां हैं जो आमतौर पर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी में झरझरा जेल मोतियों के लिए उपयोग की जाती हैं

निस्पंदन को प्रभावित करने वाले कारक
वास्तविक जीवन की स्थितियों में, समाधान में कणों का एक निश्चित आकार नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप यह संभावना होती है कि एक कण जो इसके ठीक पास से गुजरने वाले छिद्र से बाधित होगा। इसके अलावा, स्थिर-चरण कण आदर्श रूप से परिभाषित नहीं होते हैं; दोनों कण और छिद्र आकार में भिन्न हो सकते हैं। इसलिए रेफरेंस कर्व्स सामान्य वितरण  से मिलते जुलते हैं। स्थिर चरण भी एक कण के साथ अवांछनीय तरीके से बातचीत कर सकता है और अवधारण समय को प्रभावित कर सकता है, हालांकि स्तंभ निर्माताओं द्वारा स्थिर चरणों का उपयोग करने के लिए बहुत सावधानी बरती जाती है जो निष्क्रिय हैं और इस मुद्दे को कम करते हैं।

क्रोमैटोग्राफी के अन्य रूपों की तरह, स्तंभ की लंबाई बढ़ाने से रिज़ॉल्यूशन में वृद्धि होती है, और स्तंभ का व्यास बढ़ने से स्तंभ की क्षमता बढ़ जाती है। अधिकतम रिज़ॉल्यूशन के लिए उचित कॉलम पैकिंग महत्वपूर्ण है: एक ओवर-पैक कॉलम मोतियों में छिद्रों को ढहा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप रिज़ॉल्यूशन का नुकसान होता है। एक अंडर-पैक्ड कॉलम छोटी प्रजातियों के लिए सुलभ स्थिर चरण के सापेक्ष सतह क्षेत्र को कम कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उन प्रजातियों को छिद्रों में फंसने में कम समय लगता है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी तकनीकों के विपरीत, स्तंभ के शीर्ष पर एक विलायक सिर तेजी से संकल्प को कम कर सकता है क्योंकि नमूना लोड करने से पहले फैलता है, डाउनस्ट्रीम रेफरेंस को चौड़ा करता है।

विश्लेषण
सरल मैनुअल कॉलम में, एल्यूएंट को स्थिर मात्रा में एकत्र किया जाता है, जिसे भिन्न के रूप में जाना जाता है। जितने अधिक समान कण आकार में होते हैं उतनी ही अधिक संभावना होती है कि वे एक ही अंश में होते हैं और अलग से नहीं पाए जाते हैं। अधिक उन्नत कॉलम निक्षालन की लगातार निगरानी करके इस समस्या को दूर करते हैं। चित्र:Chrom SephG-50.tif|thumb|दाएं|300 px|एक पौधे के नमूने का आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राम (SEC) एकत्रित अंशों की अक्सर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जांच की जाती है ताकि कणों की एकाग्रता को निर्धारित किया जा सके। सामान्य स्पेक्ट्रोस्कोपी पहचान तकनीक अपवर्तक सूचकांक (आरआई) और पराबैंगनी (यूवी) हैं। स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से समान प्रजातियों (जैसे कि जैविक शुद्धिकरण के दौरान) को हटाते समय, प्रत्येक अंश की सामग्री की पहचान करने के लिए अन्य तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है। आरआई, कम कोण लेजर प्रकाश बिखरने, मल्टी-एंगल लेजर लाइट स्कैटरिंग MALS, यूवी, और/या चिपचिपापन मापन के साथ निरंतर प्रवाह का विश्लेषण करना भी संभव है।

रेफरेंस वॉल्यूम (Ve) आणविक हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम के लघुगणक के साथ मोटे तौर पर रैखिक घटता है। स्तंभों को अक्सर 4-5 मानक नमूनों (जैसे, ज्ञात आणविक भार के मुड़े हुए प्रोटीन) का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जाता है, और एक नमूना जिसमें थायरोग्लोबुलिन जैसे बहुत बड़े अणु होते हैं, जो शून्य मात्रा निर्धारित करते हैं। (ब्लू डेक्सट्रान की सिफारिश Vo निर्धारण के लिए नहीं की जाती है क्योंकि यह विषम है और परिवर्तनशील परिणाम दे सकता है) मानकों के रेफरेंस वॉल्यूम को थायरोग्लोबुलिन (Ve/Vo) के एल्यूशन वॉल्यूम से विभाजित किया जाता है और मानकों के आणविक भार के लॉग के खिलाफ प्लॉट किया जाता है।. SEC के शून्य आयतन के अंश में मौजूद मेटालोप्रोटीन को QPNC-PAGE द्वारा अलग किया जाता है।

जैव रासायनिक अनुप्रयोग
सामान्य तौर पर, एसईसी को कम-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटोग्राफी माना जाता है क्योंकि यह समान प्रजातियों को बहुत अच्छी तरह से नहीं पहचानता है, और इसलिए इसे अक्सर शुद्धिकरण के अंतिम चरण के लिए आरक्षित किया जाता है। तकनीक शुद्ध प्रोटीन की चतुर्धातुक संरचना का निर्धारण कर सकती है, जिसमें धीमी विनिमय समय होता है, क्योंकि इसे मूल समाधान स्थितियों के तहत किया जा सकता है, जो मैक्रोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को संरक्षित करता है। एसईसी प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भी जांच कर सकता है, क्योंकि यह हाइड्रोडायनेमिक आयतन (आणविक भार नहीं) को मापता है, जिससे एक ही प्रोटीन के मुड़े हुए और खुले हुए संस्करणों को अलग-अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट प्रोटीन डोमेन का स्पष्ट हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या क्रमशः फ़ोल्ड और अनफोल्डेड रूपों के लिए 14 Å और 36 Å हो सकता है। SEC इन दो रूपों को अलग करने की अनुमति देता है, क्योंकि इसके छोटे आकार के कारण मुड़ा हुआ रूप बहुत बाद में समाप्त हो जाता है।

पॉलीमर संश्लेषण
एसईसी का उपयोग एक संश्लेषित बहुलक के आकार और पॉलीडिस्पेरिटी दोनों के माप के रूप में किया जा सकता है, अर्थात, बहुलक अणुओं के आकार के वितरण को खोजने की क्षमता। यदि ज्ञात आकार के मानक पहले चलाए जाते हैं, तो विश्लेषण के लिए चुने गए विलायक (अक्सर THF) में रुचि के बहुलक अणुओं के आकार को निर्धारित करने के लिए एक अंशांकन वक्र बनाया जा सकता है। वैकल्पिक तरीके से, लाइट स्कैटरिंग और/या विस्कोमेट्री जैसी तकनीकों का उपयोग एसईसी के साथ ऑनलाइन पूर्ण आणविक भार प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जो ज्ञात आणविक भार के मानकों के साथ अंशांकन पर भरोसा नहीं करते हैं। समान आणविक भार वाले दो पॉलिमर के आकार में अंतर के कारण, पूर्ण निर्धारण के तरीके सामान्य रूप से अधिक वांछनीय हैं। एक विशिष्ट एसईसी प्रणाली जल्दी से (लगभग आधे घंटे में) बहुलक रसायनज्ञों को नमूने के आकार और बहुप्रकीर्णता के बारे में जानकारी दे सकती है। प्रारंभिक एसईसी का उपयोग विश्लेषणात्मक पैमाने पर बहुलक विभाजन के लिए किया जा सकता है।

कमियां
एसईसी में, द्रव्यमान को बहुलक अणुओं की हाइड्रोडायनामिक मात्रा के रूप में नहीं मापा जाता है, अर्थात समाधान में होने पर एक विशेष बहुलक अणु कितना स्थान लेता है। हालांकि, अनुमानित आणविक भार की गणना एसईसी डेटा से की जा सकती है क्योंकि आणविक भार और पॉलीस्टाइनिन के लिए हाइड्रोडायनामिक मात्रा के बीच सटीक संबंध पाया जा सकता है। इसके लिए, मानक के रूप में पॉलीस्टाइनिन का उपयोग किया जाता है। लेकिन हाइड्रोडायनामिक आयतन और आणविक भार के बीच संबंध सभी पॉलिमर के लिए समान नहीं है, इसलिए केवल एक अनुमानित माप प्राप्त किया जा सकता है। एक और दोष स्थिर चरण और विश्लेषण के बीच बातचीत की संभावना है। कोई भी अंतःक्रिया बाद के क्षालन समय की ओर ले जाती है और इस प्रकार एक छोटे विश्लेषण आकार की नकल करती है।

इस पद्धति का प्रदर्शन करते समय, एल्यूटिंग अणुओं के बैंड को चौड़ा किया जा सकता है। यह स्थिर चरण के अणुओं के माध्यम से गुजरने वाले मोबाइल चरण अणुओं के प्रवाह के कारण होने वाली अशांति से हो सकता है। इसके अलावा, आणविक थर्मल प्रसार और कांच की दीवारों के अणुओं के बीच घर्षण और एलुएंट के अणु बैंड के विस्तार में योगदान करते हैं। चौड़ा करने के अलावा, बैंड एक दूसरे के साथ ओवरलैप भी करते हैं। नतीजतन, एलुएंट आमतौर पर काफी पतला हो जाता है। बैंड को चौड़ा करने की संभावना को रोकने के लिए कुछ सावधानियां बरती जा सकती हैं। उदाहरण के लिए, कोई नमूना को स्तंभ के शीर्ष पर एक संकीर्ण, अत्यधिक केंद्रित बैंड में लागू कर सकता है। एलुएंट जितना अधिक केंद्रित होगा, प्रक्रिया उतनी ही अधिक कुशल होगी। हालांकि, एलुएंट को केंद्रित करना हमेशा संभव नहीं होता है, जिसे एक और नुकसान माना जा सकता है।

पूर्ण आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी
निरपेक्ष आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एएसईसी) एक ऐसी तकनीक है जो एक प्रकाश बिखरने वाले उपकरण को जोड़ती है, आमतौर पर बहु-कोण प्रकाश बिखरने (एमएएलएस) या स्थिर प्रकाश बिखरने (एसएलएस) का दूसरा रूप, लेकिन संभवतः एक गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) उपकरण, पूर्ण दाढ़ द्रव्यमान और / या प्रोटीन और मैक्रोमोलेक्युलस के आकार माप के लिए एक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के रूप में वे क्रोमैटोग्राफी प्रणाली से बाहर निकलते हैं।

इस मामले में "निरपेक्ष" की परिभाषा यह है कि संदर्भ मानकों के एक सेट के साथ स्तंभ पर प्रतिधारण समय का अंशांकन दाढ़ द्रव्यमान या हाइड्रोडायनामिक आकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है, जिसे अक्सर हाइड्रोडायनामिक व्यास (डी) के रूप में संदर्भित किया जाता है।H एनएम की इकाइयों में)। गैर-आदर्श कॉलम इंटरैक्शन, जैसे इलेक्ट्रोस्टैटिक या हाइड्रोफोबिक सतह इंटरैक्शन जो मानकों के सापेक्ष अवधारण समय को संशोधित करते हैं, अंतिम परिणाम को प्रभावित नहीं करते हैं। इसी तरह, विश्लेषण और मानक के बीच अंतर का पूर्ण माप पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है; उदाहरण के लिए, MALS विश्लेषण के साथ, स्वाभाविक रूप से विकृत प्रोटीनों के दाढ़ द्रव्यमान को सटीक रूप से चित्रित किया जाता है, भले ही वे समान दाढ़ द्रव्यमान वाले गोलाकार प्रोटीनों की तुलना में बहुत पहले के समय में एल्यूट करते हैं, और यह ब्रंचयुक्त पॉलिमर के लिए भी सच है, जो रैखिक संदर्भ मानकों की तुलना में देर से होता है। समान दाढ़ द्रव्यमान के साथ।  ASEC का एक अन्य लाभ यह है कि दाढ़ द्रव्यमान और/या आकार प्रत्येक बिंदु पर एक उत्तल शिखर पर निर्धारित होता है, और इसलिए शिखर के भीतर एकरूपता या बहुसंख्यता का संकेत देता है। उदाहरण के लिए, एक मोनोडिस्पर्स प्रोटीन के SEC-MALS विश्लेषण से पता चलेगा कि पूरे शिखर में समान मोलर द्रव्यमान वाले अणु होते हैं, जो मानक SEC विश्लेषण के साथ संभव नहीं है।

एसएलएस के साथ दाढ़ द्रव्यमान का निर्धारण करने के लिए एकाग्रता माप के साथ प्रकाश प्रकीर्णन माप के संयोजन की आवश्यकता होती है। इसलिए SEC-MALS में आमतौर पर लाइट स्कैटरिंग डिटेक्टर और या तो एक अंतर रेफ्रेक्टोमीटर या UV/Vis एब्जॉर्बेंस डिटेक्टर शामिल होता है। इसके अलावा, MALS rms त्रिज्या R को निर्धारित करता हैg एक निश्चित आकार सीमा से ऊपर के अणु, आमतौर पर 10 एनएम। इसलिए SEC-MALS दाढ़ द्रव्यमान से R के संबंध के माध्यम से पॉलिमर की रचना का विश्लेषण कर सकते हैंg. छोटे अणुओं के लिए, या तो डीएलएस या, अधिक सामान्य रूप से, हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या निर्धारित करने के लिए एक अंतर विस्कोमीटर जोड़ा जाता है और उसी तरह आणविक संरचना का मूल्यांकन करता है।

एसईसी-डीएलएस में, मैक्रोमोलेक्युलस के आकार को मापा जाता है क्योंकि वे आकार बहिष्करण कॉलम सेट से डीएलएस उपकरण के प्रवाह सेल में प्रवेश करते हैं। अणुओं या कणों के हाइड्रोडायनामिक आकार को मापा जाता है न कि उनके आणविक भार को। प्रोटीन के लिए हाइड्रोडायनामिक आकार से आणविक भार का अनुमान लगाने के लिए मार्क-हौविंक प्रकार की गणना का उपयोग किया जा सकता है।

SEC के साथ मिलकर DLS का एक प्रमुख लाभ बढ़ा हुआ DLS रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की क्षमता है। बैच डीएलएस त्वरित और सरल है और औसत आकार का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है, लेकिन डीएलएस का आधारभूत रिज़ॉल्यूशन व्यास में 3:1 का अनुपात है। SEC का उपयोग करते हुए, प्रोटीन और प्रोटीन ओलिगोमर्स को अलग किया जाता है, जिससे ओलिगोमेरिक रिज़ॉल्यूशन की अनुमति मिलती है। ASEC का उपयोग करके एकत्रीकरण अध्ययन भी किया जा सकता है। हालांकि समग्र एकाग्रता की गणना प्रकाश प्रकीर्णन के साथ नहीं की जा सकती है (एक ऑनलाइन एकाग्रता डिटेक्टर जैसे कि दाढ़ द्रव्यमान माप के लिए SEC-MALS में उपयोग किया जाता है, जो कुल एकाग्रता को भी निर्धारित करता है), समुच्चय का आकार मापा जा सकता है, केवल अधिकतम आकार द्वारा सीमित किया जा सकता है। एसईसी कॉलम से।

डीएलएस पहचान के साथ एएसईसी की सीमाओं में प्रवाह-दर, एकाग्रता और सटीकता शामिल है। क्योंकि एक सहसंबंध समारोह को ठीक से बनाने के लिए कहीं भी 3-7 सेकंड की आवश्यकता होती है, इसलिए शिखर पर सीमित संख्या में डेटा बिंदु एकत्र किए जा सकते हैं। एसएलएस पहचान के साथ एएसईसी प्रवाह दर से सीमित नहीं है और माप समय अनिवार्य रूप से तात्कालिक है, और एकाग्रता की सीमा डीएलएस के मुकाबले परिमाण के कई आदेश हैं। हालांकि, SEC-MALS के साथ दाढ़ द्रव्यमान विश्लेषण के लिए सटीक एकाग्रता माप की आवश्यकता होती है। एसईसी द्वारा अलगाव के बाद अधिक व्यापक पूर्ण विश्लेषण के लिए एमएएलएस और डीएलएस डिटेक्टरों को अक्सर एक ही उपकरण में जोड़ा जाता है।

यह भी देखें

 * पेगिलेशन
 * जेल पर्मिएशन क्रोमेटोग्राफी
 * प्रोटीन शुद्धि

बाहरी संबंध
Gel-Permeations-Chromatografie クロマトグラフィー