सेंगर अनुक्रमण

सेंगर अनुक्रमण डीएनए अनुक्रमण की एक विधि है जिसमें वैद्युतकणसंचलन सम्मिलित है और पात्रे डीएनए प्रतिकृति के समय डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा श्रृंखला समापन डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड के यादृच्छिक समावेश पर आधारित है। 1977 में पहली बार फ्रेडरिक सिंगर और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किए जाने के बाद, यह लगभग 40 वर्षों के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली अनुक्रमण विधि बन गई। इसका पहली बार 1986 में अनुप्रयुक्त जैवतंत्र द्वारा व्यावसायीकरण किया गया था। वर्तमान में, उच्च मात्रा सेंगर अनुक्रमण को अगली पीढ़ी के विधियों अनुक्रमण विधियों द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर, स्वचालित जीनोम विश्लेषण के लिए। यद्यपि, छोटे पैमाने की परियोजनाओं के लिए और गहन अनुक्रमण परिणामों के सत्यापन के लिए सेंगर विधि व्यापक उपयोग में बनी हुई है। यह अभी भी लघु पठन अनुक्रमण तकनीकों (जैसे इल्लुमिना) पर लाभ है कि यह डीएनए अनुक्रम पठन> 500 न्यूक्लियोटाइड का उत्पादन कर सकता है और लगभग 99.99% यथार्थता के साथ बहुत कम त्रुटि दर बनाए रखता है। सार्स-सीओवी-2 से स्पाइक प्रोटीन के अनुक्रमण के साथ-साथ रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) कैलिसीनेट सर्वेक्षण नेटवर्क के माध्यम से नोरोवायरस के प्रकोप की सर्वेक्षण के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रस्ताव के प्रयासों में सेंगर अनुक्रमण अभी भी सक्रिय रूप से उपयोग किया जा रहा है।

विधि
[[FIle:Флуоресцентные дидезокситерминаторы Сангер.svg|thumb|right|[[रोशनी]] डीडीएनटीपी अणु

शास्त्रीय श्रृंखला-समापन विधि के लिए एकल- गुंफित डीएनए रूपदा, एक डीएनए उपक्रामक (आणविक जीव विज्ञान), एक डीएनए पोलीमरेज़, सामान्य डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी), और संशोधित डी-डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीडीएनटीपी) की आवश्यकता होती है, जिनमें से बाद में डीएनए गुंफित दीर्घीकरण समाप्त हो जाता है। इन श्रृंखला समापन न्यूक्लियोटाइड में दो न्यूक्लियोटाइड के बीच फॉस्फोडाइएस्टर बंधन के गठन के लिए आवश्यक 3'- हाइड्रॉकसिल समूह की कमी होती है, जिससे डीएनए पोलीमरेज़ डीएनए के विस्तार को समाप्त कर देता है जब एक संशोधित डीडीएनटीपी सम्मिलित होता है। स्वचालित अनुक्रमण मशीनों में पता लगाने के लिए डीडीएनटीपी को रेडियोधर्मी या प्रतिदीप्ति रूप से लेबल किया जा सकता है।

डीएनए प्रतिदर्श को चार अलग-अलग अनुक्रमण अभिक्रियाओं में विभाजित किया गया है, जिसमें सभी चार मानक डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड-ट्राइफॉस्फेट (डीएटीपी, डीजीटीपी, डीसीटीपी और डीटीटीपी) और डीएनए पोलीमरेज़ सम्मिलित हैं। प्रत्येक अभिक्रिया में मात्र चार डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड (डीडीएटीपी, डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी, या डीडीटीटीपी) में से एक जोड़ा जाता है, जबकि अन्य जोड़े गए न्यूक्लियोटाइड सामान्य होते हैं। डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड सांद्रता संबंधित डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड (जैसे 0.5मिमी डीटीटीपी: 0.005मिमी डीडीटीटीपी) की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक होनी चाहिए ताकि पूर्ण अनुक्रम का प्रतिलेखन करते समय पर्याप्त अंशों का उत्पादन किया जा सके (परन्तु डीडीएनटीपी की एकाग्रता अनुक्रम की वांछित लंबाई पर भी निर्भर करती है)। इसे और अधिक संवेदी क्रम में रखते हुए, इस प्रक्रिया में सभी चार डीडीएनटीपी का परीक्षण करने के लिए चार अलग-अलग अभिक्रियाओं की आवश्यकता होती है। बाध्य उपक्रामक से रूपदा डीएनए विस्तार के आवर्तन के बाद, परिणामी डीएनए खंड ऊष्मा डीएनए विकृतीकरण होते हैं और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके आकार से अलग होते हैं। 1977 के मूल प्रकाशन में, एसएसडीएनए के आधार-युग्मित पाश का गठन कुछ स्थानों पर बैंड को हल करने में गंभीर कठिनाई का कारण था। यह प्रायः चार अलग-अलग लेन (लेन ए, टी, जी, सी) में से एक में चलने वाली चार अभिक्रियाओं में से प्रत्येक के साथ एक विकृतीयन पॉलीएक्रिलामाइड जेल-यूरिया जेल का उपयोग करके किया जाता है। फिर स्वतः रेडियोलेखन या यूवी प्रकाश द्वारा डीएनए बैंड की कल्पना की जा सकती है, और डीएनए अनुक्रम को रेडियोलेखन या जेल प्रतिरूप से सीधे पढ़ा जा सकता है। दाईं ओर की प्रतिरूप में, रेडियोलेखन को जेल के संपर्क में लाया गया था, और अदीप्त बैंड विभिन्न लंबाई के डीएनए अंशों के अनुरूप हैं। एक लेन में एक अदीप्त बैंड एक डीएनए खंड को इंगित करता है जो कि डाइडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड (डीडीएटीपी, डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी, या डीडीटीटीपी) के समावेश के बाद श्रृंखला समाप्ति का परिणाम है। फिर नीचे से ऊपर तक चार लेन के बीच विभिन्न बैंडों की सापेक्ष स्थिति का उपयोग डीएनए अनुक्रम को पढ़ने के लिए किया जाता है।

श्रृंखला-समाप्ति अनुक्रमण की तकनीकी विविधताओं में समस्थानिक लेबलन के लिए रेडियोधर्मी फॉस्फोरस युक्त न्यूक्लियोटाइड के साथ टैगन, या प्रतिदीप्ति रंजक के साथ 5' छोर पर लेबल किए गए उपक्रामक का उपयोग करना सम्मिलित है। रंजक-उपक्रामक अनुक्रमण तीव्रता से और अधिक किफायती विश्लेषण और स्वचालन के लिए एक ऑप्टिकल सिस्टम में पढ़ने की सुविधा प्रदान करता है। लेरॉय हुड और सहकर्मियों द्वारा बाद में विकास of fluorescently labeled डीडीएनटीपी and primers set the stage for automated, high-throughput DNA sequencing.श्रृंखला-समाप्ति विधियों ने डीएनए अनुक्रमण को बहुत सरल बना दिया है। उदाहरण के लिए, चेन-टर्मिनेशन-आधारित किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं जिनमें अनुक्रमण के लिए आवश्यक अभिकर्मक, पूर्व-विभाज्य और उपयोग के लिए तैयार हैं। सीमाओं में डीएनए के लिए उपक्रामक का गैर-विशिष्ट बंधन सम्मिलित है, जो डीएनए अनुक्रम के यथार्थ पठन दर्श को प्रभावित करता है, और डीएनए माध्यमिक संरचनाएं अनुक्रम की निष्ठा को प्रभावित करती हैं।

रंजक-टर्मिनेटर अनुक्रमण
रंजक-टर्मिनेटर अनुक्रमण श्रृंखला टर्मिनेटर डीडीएनटीपी की लेबलन का उपयोग करता है, जो लेबल-उपक्रामक विधि के अनुसार चार अभिक्रियाओं के बजाय एकल अभिक्रिया में अनुक्रमण की अनुमति देता है। रंजक-टर्मिनेटर अनुक्रमण में, चार डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला टर्मिनेटरों में से प्रत्येक को फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश का उत्सर्जन करता है।

इसकी अधिक समीचीनता और गति के कारण, रंजक-टर्मिनेटर अनुक्रमण अब स्वचालित अनुक्रमण में मुख्य आधार है। इसकी सीमाओं में रंजक-लेबल वाले चेन टर्मिनेटरों को डीएनए के खंड में सम्मिलित करने में अंतर के कारण रंजक प्रभाव सम्मिलित हैं, जिसके परिणामस्वरूप केशिका वैद्युतकणसंचलन के बाद इलेक्ट्रॉनिक डीएनए अनुक्रम ट्रेस वर्णलेख में असमान चोटी की ऊंचाई और आकार होते हैं (बाईं ओर आंकड़ा देखें)।

इस समस्या को संशोधित डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम सिस्टम और रंगों के उपयोग से संबोधित किया गया है जो निगमन परिवर्तनशीलता को कम करते हैं, साथ ही रंजक बूँद को खत्म करने के विधि भी। रंजक-टर्मिनेटर अनुक्रमण विधि, स्वचालित उच्च-थ्रूपुट डीएनए अनुक्रम विश्लेषक के साथ, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की शुरूआत तक अनुक्रमण परियोजनाओं के विशाल बहुमत के लिए उपयोग की गई थी।

स्वचालन और प्रतिदर्श तैयार करना
स्वचालित डीएनए-अनुक्रमण उपकरण (डीएनए सीक्वेंसर) एक बैच में 384 डीएनए प्रतिदर्शों तक का अनुक्रम कर सकते हैं। बैच रन दिन में 24 बार तक हो सकते हैं। केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके डीएनए सीक्वेंसर आकार (या लंबाई) द्वारा किस्में अलग करते हैं, वे रंजक प्रतिदीप्ति का पता लगाते हैं और रिकॉर्ड करते हैं, और फ्लोरोसेंट पीक ट्रेस क्रोमैटोग्राम के रूप में आउटपुट डेटा। सीक्वेंसर पर सैंपल लोड करने से पहले, बफर द्रावण में सैंपल की सीक्वेंसिंग रिएक्शन (thermocycler और लेबलन ), क्लीनअप और सैंपल की री-सस्पेंशन अलग से की जाती है। कई वाणिज्यिक और गैर-वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर पैकेज निम्न-गुणवत्ता वाले डीएनए निशानों को स्वचालित रूप से ट्रिम कर सकते हैं। ये कार्यक्रम प्रत्येक चोटी की गुणवत्ता को स्कोर करते हैं और निम्न-गुणवत्ता वाले आधार चोटियों को हटाते हैं (जो आम तौर पर अनुक्रम के अंत में स्थित होते हैं)। ऐसे एल्गोरिदम की यथार्थता मानव ऑपरेटर द्वारा दृश्य परीक्षा से कम है, परन्तु बड़े अनुक्रम डेटा सेटों के स्वचालित प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त है।

रंजक-टर्मिनेटिंग सीक्वेंसिंग के अनुप्रयोग
सार्वजनिक स्वास्थ्य का क्षेत्र रोगी निदान के साथ-साथ संभावित विषाक्त पदार्थों की पर्यावरणीय सर्वेक्षण और जैविक रोगजनकों को प्रसारित करने में कई भूमिकाएँ निभाता है। सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं (PHL) और दुनिया भर की अन्य प्रयोगशालाओं ने वायरस की सर्वेक्षण के लिए तीव्रता से अनुक्रमण डेटा प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 | सार्स-सीओवी-2, COVID-19 के लिए प्रेरक एजेंट, के समय महामारी जिसे 30 जनवरी, 2020 को सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकाल घोषित किया गया था। प्रयोगशालाओं को अनुक्रमण विधियों के तीव्रता से कार्यान्वयन का काम सौंपा गया था और वायरस के प्रसार को कम करने के लिए नीतियों के विकास के लिए निर्णय लेने वाले मॉडल में सहायता के लिए यथार्थ डेटा प्रदान करने के लिए कहा गया था। कई प्रयोगशालाओं ने अगली पीढ़ी की अनुक्रमण पद्धतियों का सहारा लिया जबकि अन्य ने सेंगर अनुक्रमण के प्रयासों का समर्थन किया। सार्स-सीओवी-2 के अनुक्रमण प्रयास कई हैं, जबकि अधिकांश प्रयोगशालाओं ने वायरस के पूरे जीनोम अनुक्रमण को लागू किया है, अन्य ने वायरस के बहुत विशिष्ट जीन जैसे S-जीन को अनुक्रमित करने का विकल्प चुना है, जो स्पाइक प्रोटीन के उत्पादन के लिए आवश्यक जानकारी को एन्कोडिंग करता है।. सार्स-सीओवी-2 की उच्च उत्परिवर्तन दर S-जीन के भीतर आनुवंशिक अंतर की ओर ले जाती है और इन अंतरों ने वायरस की संक्रामकता में भूमिका निभाई है। एस-जीन का सेंगर अनुक्रमण आनुवंशिक कोड को पुनः प्राप्त करने के लिए एक त्वरित, यथार्थ और अधिक किफायती विधि प्रदान करता है। कम आय वाले देशों में प्रयोगशालाओं में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसे महंगे अनुप्रयोगों को लागू करने की क्षमता नहीं हो सकती है, इसलिए वैरिएंट की सर्वेक्षण के लिए अनुक्रमण डेटा की पीढ़ी के समर्थन में सेंगर विधियाँ प्रबल हो सकती हैं।

रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) कैलिसीनेट नेटवर्क के लिए नोरोवायरस सर्वेक्षण विधियों के लिए सेंगर अनुक्रमण भी स्वर्ण मानक है। CalciNet एक आउटब्रेक सर्विलांस नेटवर्क है जिसे मार्च 2009 में स्थापित किया गया था। नेटवर्क का लक्ष्य संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रसारित नोरोवायरस के अनुक्रमण डेटा एकत्र करना और वायरस के प्रसार को कम करने के लिए संक्रमण के स्रोत को निर्धारित करने के लिए डाउनस्ट्रीम कार्रवाई को सक्रिय करना है। CalciNet नेटवर्क ने खाद्य जनित बीमारियों के रूप में कई संक्रमणों की पहचान की है। इस डेटा को तब प्रकाशित किया जा सकता है और भोजन को खराब होने से बचाने के लिए भविष्य की कार्रवाई के लिए सिफारिशें विकसित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। नोरोवायरस का पता लगाने के लिए नियोजित विधियों में जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों का लक्षित प्रवर्धन सम्मिलित है। एम्पलीकॉन्स को तब रंजक-टर्मिनेटिंग सेंगर सीक्वेंसिंग का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है और उत्पन्न क्रोमैटोग्राम और अनुक्रमों का बायोन्यूमेरिक्स में विकसित एक सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ विश्लेषण किया जाता है। अनुक्रमों को ट्रैक किया जाता है और महामारी संबंधी प्रासंगिकता का अनुमान लगाने के लिए तनाव संबंधीता का अध्ययन किया जाता है।

चुनौतियां
सेंगर पद्धति के साथ डीएनए अनुक्रमण की सामान्य चुनौतियों में उपक्रामक बाइंडिंग के कारण अनुक्रम के पहले 15-40 आधारों में खराब गुणवत्ता और 700-900 आधारों के बाद अनुक्रमण निशान की बिगड़ती गुणवत्ता सम्मिलित है। आधार कॉलिंग सॉफ़्टवेयर जैसे Phred (सॉफ़्टवेयर) आमतौर पर अनुक्रमों के निम्न-गुणवत्ता वाले क्षेत्रों को ट्रिम करने में सहायता करने के लिए गुणवत्ता का अनुमान प्रदान करता है। <रेफरी नाम = अगली पीढ़ी के सीक्वेंसिंग प्लेटफॉर्म के लिए urlआधार-कॉलिंग — संक्षिप्त जैव सूचना >

ऐसे मामलों में जहां डीएनए अंशों को अनुक्रमण से पहले क्लोन किया जाता है, परिणामी अनुक्रम में क्लोनिंग वेक्टर के भाग सम्मिलित हो सकते हैं। इसके विपरीत, पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया क्लोनिंग और अगली पीढ़ी की pyrosequencing प्रौद्योगिकियाँ पाइरोग्रेडिंग पर आधारित होती हैं, जो प्रायः क्लोनिंग वैक्टर का उपयोग करने से बचती हैं। वर्तमान में, एक-चरणीय सेंगर अनुक्रमण (संयुक्त प्रवर्धन और अनुक्रमण) विधियों जैसे एम्प्लिसेक और सेक्शार्प विकसित किए गए हैं जो क्लोनिंग या पूर्व प्रवर्धन के बिना लक्ष्य जीनों की तीव्र अनुक्रमण की अनुमति देते हैं। रेफरी> मौजूदा विधि मात्र एक अभिक्रिया में मात्र अपेक्षाकृत कम (300-1000 न्यूक्लियोटाइड लंबे) डीएनए अंशों को अनुक्रमित कर सकते हैं। इस आकार सीमा से ऊपर के डीएनए अंशों के अनुक्रमण में मुख्य बाधा बड़े डीएनए अंशों को हल करने के लिए पृथक्करण की अपर्याप्त शक्ति है जो मात्र एक न्यूक्लियोटाइड द्वारा लंबाई में भिन्न होती है।

माइक्रोफ्लुइडिक सेंगर सीक्वेंसिंग
माइक्रोफ्लुइडिक सेंगर अनुक्रमण डीएनए अनुक्रमण के लिए एक प्रयोगशाला-ऑन-अ-चिप अनुप्रयोग है, जिसमें सेंगर अनुक्रमण चरण (थर्मल साइकलिंग, प्रतिदर्श शुद्धिकरण, और केशिका वैद्युतकणसंचलन) को नैनोलिटर-स्केल प्रतिदर्श वॉल्यूम का उपयोग करके वेफर-स्केल चिप पर एकीकृत किया जाता है। सेंगर अनुक्रमण चरणों को एकीकृत और स्वचालित करके पारंपरिक सेंगर विधि (जैसे महंगे अभिकर्मकों की उच्च खपत, महंगे उपकरणों पर निर्भरता, कर्मियों-गहन हेरफेर, आदि) की कई महत्वपूर्ण कमियों को दूर करते हुए, यह तकनीक लंबी और यथार्थ अनुक्रम पढ़ती है।.

अपनी आधुनिक स्थापना में, उच्च-थ्रूपुट जीनोम अनुक्रमण में जीनोम को छोटे एकल- गुंफित टुकड़ों में विभाजित करना सम्मिलित है, इसके बाद पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा टुकड़ों का प्रवर्धन किया जाता है। सेंगर विधि को अपनाते हुए, प्रत्येक डीएनए टुकड़ा अपरिवर्तनीय रूप से एक फ्लोरोसेंटली लेबल वाले डिडॉक्सी श्रृंखला समापन न्यूक्लियोटाइड के समावेश के साथ समाप्त हो जाता है, जिससे टुकड़ों का एक डीएनए "सीढ़ी" बनता है जो प्रत्येक लंबाई में एक आधार से भिन्न होता है और आधार-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल को सहन करता है। टर्मिनल आधार। प्रवर्धित आधार लैडर को तब केशिका सरणी वैद्युतकणसंचलन (CAE) द्वारा स्वचालित रूप से अलग किया जाता है, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ssDNA अंशों की "फिनिश-लाइन" पहचान में, जो अंशों का एक क्रमबद्ध क्रम प्रदान करता है। इन अनुक्रमों को पढ़ा जाता है, फिर कंप्यूटर को ओवरलैपिंग या सन्निहित अनुक्रमों (जिसे कंटिग्स कहा जाता है) में इकट्ठा किया जाता है, जो एक बार पूरी तरह से इकट्ठे होने पर पूर्ण जीनोमिक अनुक्रम जैसा दिखता है।

सेंगर विधियाँ लगभग 800 बीपी की अधिकतम पठन लंबाई प्राप्त करती हैं (आमतौर पर गैर-समृद्ध डीएनए के साथ 500-600 बीपी)। सेंगर विधियों में लंबे समय तक पढ़ी जाने वाली लंबाई अन्य अनुक्रमण विधियों पर विशेष रूप से जीनोम के दोहराए जाने वाले क्षेत्रों के अनुक्रमण के संदर्भ में महत्वपूर्ण लाभ प्रदर्शित करती है। लघु पठन अनुक्रमण डेटा की एक चुनौती विशेष रूप से नए जीनोम (डे नोवो) के अनुक्रमण में और अत्यधिक पुनर्व्यवस्थित जीनोम खंडों के अनुक्रमण में एक समस्या है, आमतौर पर कैंसर जीनोम या गुणसूत्रों के क्षेत्रों में जो संरचनात्मक भिन्नता प्रदर्शित करते हैं।

माइक्रोफ्लुइडिक अनुक्रमण तकनीकों के अनुप्रयोग
डीएनए अनुक्रमण के अन्य उपयोगी अनुप्रयोगों में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) का पता लगाना, एकल कतरा रचना बहुरूपता | जीनोम की इन विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए आकार और/या संरचना में अंतर के अनुसार डीएनए अंशों को हल करना सबसे महत्वपूर्ण कदम है।

डिवाइस डिजाइन
सीक्वेंसिंग चिप में एक चार-परत का निर्माण होता है, जिसमें तीन 100-मिमी-व्यास वाले ग्लास वेफर्स (जिस पर उपकरण तत्व माइक्रोफैब्रिकेटेड होते हैं) और एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) झिल्ली होती है। अभिक्रिया कक्षों और केशिका वैद्युतकणसंचलन चैनलों को शीर्ष दो ग्लास वेफर्स के बीच उकेरा जाता है, जो ऊष्मीय रूप से बंधे होते हैं। PDMS और बॉटम मैनिफोल्ड ग्लास वेफर द्वारा त्रि-आयामी चैनल इंटरकनेक्शन और माइक्रोवाल्व बनते हैं।

डिवाइस में तीन कार्यात्मक इकाइयाँ होती हैं, जिनमें से प्रत्येक सेंगर अनुक्रमण चरणों के अनुरूप होती हैं। थर्मल साइकलिंग (टीसी) इकाई एक 250-नैनोलिटर अभिक्रिया कक्ष है जिसमें एकीकृत प्रतिरोधक तापमान डिटेक्टर, माइक्रोवाल्व और एक सतह हीटर है। शीर्ष ऑल-ग्लास परत और निचली ग्लास-पीडीएमएस परत के बीच अभिकर्मक का संचलन 500-माइक्रोन-व्यास वाया-होल के माध्यम से होता है। थर्मल-साइकलिंग के बाद, अभिक्रिया मिश्रण कैप्चर/शुद्धि कक्ष में शुद्धिकरण से गुजरता है, और फिर केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) कक्ष में इंजेक्ट किया जाता है। सीई इकाई में 30-सेमी केशिका होती है जो 65-माइक्रोन-चौड़े घुमावों के माध्यम से कॉम्पैक्ट स्विचबैक पैटर्न में तब्दील हो जाती है।

अनुक्रमण रसायन

 * ठंडा - गरम करना
 * टीसी अभिक्रिया कक्ष में, रंजक-टर्मिनेटर अनुक्रमण अभिकर्मक, रूपदा डीएनए, और उपक्रामक को टीसी कक्ष और थर्मल साइकिलर में लोड किया जाता है। थर्मल-साइकिल 35 चक्रों के लिए (12 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर और 55 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर) ).


 * शुद्धिकरण
 * आवेशित अभिक्रिया मिश्रण (विस्तार खंड, रूपदा डीएनए, और अतिरिक्त अनुक्रमण अभिकर्मक युक्त) कैप्चर आउटलेट और इनलेट बंदरगाहों के बीच लागू 33-वोल्ट/सेमी विद्युत क्षेत्र के माध्यम से 30 डिग्री सेल्सियस पर एक कैप्चर/शुद्धि कक्ष के माध्यम से आयोजित किया जाता है। कैप्चर जेल जिसके माध्यम से प्रतिदर्श संचालित होता है, में 40 μM ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (उपक्रामक्स के पूरक) होते हैं जो सहसंयोजक रूप से एक पॉलीएक्रिलामाइड मैट्रिक्स से बंधे होते हैं। एक्सटेंशन के खंड जेल मैट्रिक्स द्वारा स्थिर होते हैं, और अतिरिक्त उपक्रामक, रूपदा, फ्री न्यूक्लियोटाइड और लवण कैप्चर वेस्ट पोर्ट के माध्यम से निकाले जाते हैं। विस्तार अंशों को मुक्त करने के लिए कैप्चर जेल को 67-75 °C तक गर्म किया जाता है।


 * केशिका वैद्युतकणसंचलन
 * विस्तार अंशों को CE कक्ष में इंजेक्ट किया जाता है जहां उन्हें 125-167-V/cm क्षेत्र के माध्यम से इलेक्ट्रोफोरेस किया जाता है।

प्लेटफॉर्म
अपोलो 100 प्लेटफॉर्म (माइक्रोचिप बायोटेक्नोलॉजीज इंक, डबलिन, सीए) पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली में पहले दो सेंगर अनुक्रमण चरणों (थर्मल साइकलिंग और शुद्धिकरण) को एकीकृत करता है। निर्माता का दावा है कि प्रतिदर्श के तीन घंटे के भीतर केशिका वैद्युतकणसंचलन के लिए तैयार हैं और सिस्टम में अभिकर्मकों को लोड किया जा रहा है। अपोलो 100 प्लेटफॉर्म को अभिकर्मकों के उप-माइक्रोलिटर वॉल्यूम की आवश्यकता होती है।

अन्य अनुक्रमण तकनीकों की तुलना
उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का अंतिम लक्ष्य उन प्रणालियों को विकसित करना है जो कम लागत वाली हैं, और विस्तारित (लंबी) पढ़ने की लंबाई प्राप्त करने में अत्यंत कुशल हैं। प्रत्येक एकल वैद्युतकणसंचलन जुदाई की लंबी लंबाई, डे नोवो डीएनए अनुक्रमण से जुड़ी लागत को काफी हद तक कम कर देती है और किसी दिए गए अतिरेक पर डीएनए कॉन्टिग्स को अनुक्रमित करने के लिए आवश्यक रूपदा्स की संख्या को कम कर देती है। माइक्रोफ्लुइडिक्स तीव्र, सस्ता और आसान अनुक्रम असेंबली की अनुमति दे सकता है।

यह भी देखें

 * दूसरी पीढ़ी अनुक्रमण
 * तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण

बाहरी संबंध

 * MBI Says New Tool That Automates Sanger Sample Prep Cuts Reagent and Labor Costs

Sanger-Methode