प्रोटीन अवक्षेपण

प्रोटीन को केंद्रित करने और उन्हें विभिन्न दूषित पदार्थों से शुद्ध करने के लिए जैविक उत्पादों के अधः प्रवाह प्रसंस्करण में प्रोटीन अवक्षेपण का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, जैव प्रौद्योगिकी उद्योग में प्रोटीन अवक्षेपण का उपयोग प्रायः रक्त में उपस्थित दूषित पदार्थों को खत्म करने के लिए किया जाता है। अवक्षेपण का अंतर्निहित तंत्र एक अभिकर्मक के अतिरिक्त विलेय की विलेयता को कम करके, विशेष रूप से, विलायक की घुलनशीलता  को परिवर्तित करना है।

सामान्य सिद्धांत
जलीय बफ़र् में प्रोटीन की घुलनशीलता प्रोटीन की सतह पर  जलस्‍नेही और जलविरागी एमीनो अम्ल अवशेषों के वितरण पर निर्भर करती है।जलविरागी अवशेष मुख्य रूप से गोलाकार प्रोटीन कोर में होते हैं, लेकिन कुछ सतह पर पैच में उपस्थित होते हैं। जिन प्रोटीनों की सतह पर उच्च जलविरागी एमीनो अम्ल सामग्री होती है, उनमें जलीय विलायक में कम घुलनशीलता होती है। आवेशित और ध्रुवीय सतह के अवशेष विलायक में आयनिक समूहों के साथ परस्पर क्रिया करते हैं और प्रोटीन की विलेयता को बढ़ाते हैं।एक प्रोटीन के अमीनो अम्ल संरचना का ज्ञान एक आदर्श अवक्षेपण  विलायक और विधियों को निर्धारित करने में सहायता करेगा।

प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल
प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल तब उत्पन्न होता हैं जब विद्युत् अपघट्य विलयन में प्रोटीन घुल जाती है। प्रोटीन के मध्य ये प्रतिकर्षक  बल एकत्रीकरण को रोकते हैं और विघटन की सुविधा प्रदान करते हैं।  विद्युत् अपघट्य विलयन में घुलने पर, विलायक काउंटर प्रोटीन पर आवेशित किए गए सतह अवशेषों की ओर पलायन करते हैं, जिससे प्रोटीन की सतह पर काउंटरों का एक कठोर सांचा बनता है। इस परत के समीप एक और विलायक परत है जो कम कठोर है और जैसे ही यह प्रोटीन की सतह से दूर जाता है, उसमें एक कमी होती है,काउंटरों की घटती सांद्रता और सह-आयनों की बढ़ती सांद्रता सम्मिलित है। इन विलायकयोजन परतों की उपस्थिति के कारण प्रोटीन का अन्य प्रोटीनों के साथ कम आयनिक संपर्क होता है और एकत्रीकरण की संभावना कम हो जाती है। प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल तब उत्पन्न होता हैं जब प्रोटीन जल में घुल जाता  हैं। जल एक प्रोटीन के जलंरागी सतह अवशेषों के चारों ओर एक विलायक परत बनाता है। पानी उच्चतम सांद्रता के साथ प्रोटीन के चारों ओर एक सांद्रता प्रवणता स्थापित करता है।

आकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल
स्थायी और प्रेरित द्विध्रुवों के माध्यम से प्रोटीन के बीच फैलाव या आकर्षक बल उपस्थित होते हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन पर मूल अवशेषों में अन्य प्रोटीन पर अम्लीय अवशेषों के साथ स्थिर वैद्युत विक्षेप पारस्परिक प्रभाव हो सकते हैं। यद्यपि विद्युत् अपघटनी विलयन या जल में आयनों द्वारा विलायक योजन प्रोटीन-प्रोटीन आकर्षक बलों को कम करेगा। इसलिए, प्रोटीन के संचय को तीव्र या प्रेरित करने के लिए, प्रोटीन के चारों ओर जलयोजन परत को कम किया जाना चाहिए।प्रोटीन अवक्षेपण में संयोजित किये गए अभिकर्मकों का उद्देश्य जलयोजन परत को कम करना है।

अवक्षेपण गठन
प्रोटीन अवक्षेप का निर्माण एक चरणबद्ध प्रक्रिया में होता है। सबसे पहले, एक अवक्षेपण एजेंट जोड़ा जाता है और समाधान लगातार मिश्रित होता है। मिलाने से अवक्षेपक और प्रोटीन आपस में टकराते हैं। द्रव भंवरों में अणुओं के विसरण के लिए पर्याप्त मिश्रण समय की आवश्यकता होती है। इसके बाद, प्रोटीन एक केंद्रक  चरण से गुजरते हैं, जहां सबमरोस्कोपिक आकार के प्रोटीन समुच्चय या कण उत्पन्न होते हैं। इन कणों की वृद्धि ब्राउनियन विसरण नियंत्रण के अंतर्गत होती है। एक बार जब कण एक महत्वपूर्ण आकार (क्रमशः उच्च और निम्न कतरनी (द्रव) क्षेत्रों के लिए 0.1 माइक्रोमीटर से 10 माइक्रोमीटर) तक पहुंच जाते हैं, तो इसमें अलग-अलग प्रोटीन अणुओं के विसरित जोड़ से, वे एक-दूसरे से टकराकर और चिपककर या प्रवाहित होकर बढ़ते रहते हैं। यह चरण धीमी गति से होता है। अंतिम चरण के दौरान, जिसे कतरनी क्षेत्र में उम्र बढ़ने कहा जाता है, अवक्षेपित कण बार-बार टकराते और चिपकते हैं, फिर अलग हो जाते हैं, जब तक कि एक स्थिर औसत कण आकार तक नहीं पहुंच जाता, जो व्यक्तिगत प्रोटीन पर निर्भर होता है। प्रोटीन कणों की यांत्रिक शक्ति औसत कतरनी दर और उम्र बढ़ने के समय के उत्पाद से संबंधित होती है, जिसे शिविर संख्या के रूप में जाना जाता है। उम्र बढ़ने से कणों को आकार में कमी किए बिना पंपों और सेंट्रीफ्यूज फीड जोन में आने वाले द्रव कतरनी बलों का सामना करने में मदद मिलती है।

नमस्कार निकालना
प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम विधि है नमकीन बनाना। अमोनियम सल्फेट जैसे तटस्थ नमक को मिलाने से सॉल्वेशन परत संकुचित हो जाती है और प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया बढ़ जाती है। जैसे ही एक घोल की नमक की सघनता बढ़ जाती है, प्रोटीन की सतह पर आवेश नमक के साथ परस्पर क्रिया करता है, न कि पानी से, जिससे प्रोटीन की सतह पर हाइड्रोफोबिक पैच उजागर हो जाते हैं और प्रोटीन घोल से बाहर गिर जाता है (कुल और अवक्षेपित)।

नमक बाहर निकालने में शामिल ऊर्जा
नमक निकालना एक सहज प्रक्रिया है जब नमक की सही सांद्रता घोल में पहुँच जाती है। प्रोटीन की सतह पर हाइड्रोफोबिक पैच अत्यधिक क्रमबद्ध पानी के गोले उत्पन्न करते हैं। इसके परिणामस्वरूप थोक समाधान में अणुओं के सापेक्ष आदेशित पानी के अणुओं के थैलेपी, ΔH, और एन्ट्रापी, ΔS में एक बड़ी कमी में कमी आती है। प्रक्रिया का समग्र थर्मोडायनामिक मुक्त ऊर्जा परिवर्तन, ΔG, गिब्स मुक्त ऊर्जा समीकरण द्वारा दिया गया है:
 * $$ \Delta G = \Delta H - T \Delta S.$$

ΔG = मुक्त ऊर्जा परिवर्तन, ΔH = वर्षण पर एन्थैल्पी परिवर्तन, ΔS = वर्षण पर एन्ट्रापी परिवर्तन, T = निरपेक्ष तापमान। जब कठोर सॉल्वैंशन परत में पानी के अणुओं को जोड़े गए नमक के साथ बातचीत के माध्यम से बल्क चरण में वापस लाया जाता है, तो उनकी गति की अधिक स्वतंत्रता उनके एंट्रॉपी में महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनती है। इस प्रकार, ΔG ऋणात्मक हो जाता है और अवक्षेपण अनायास होता है।

हॉफमिस्टर सीरीज
कोस्मोट्रोप्स या जल संरचना स्टेबलाइजर्स लवण होते हैं जो एक प्रोटीन के चारों ओर सॉल्वैंशन परत से पानी के अपव्यय/फैलाव को बढ़ावा देते हैं। हाइड्रोफोबिक पैच तब प्रोटीन की सतह पर उजागर होते हैं, और वे अन्य प्रोटीनों पर हाइड्रोफोबिक पैच के साथ इंटरैक्ट करते हैं। ये लवण प्रोटीन एकत्रीकरण और वर्षा को बढ़ाते हैं। Chaotropes या जल संरचना तोड़ने वाले, Kosmotropes के विपरीत प्रभाव डालते हैं। ये लवण एक प्रोटीन के चारों ओर सॉल्वैंशन परत में वृद्धि को बढ़ावा देते हैं। अवक्षेपित प्रोटीन में कोस्मोट्रोपिक लवण की प्रभावशीलता हॉफमिस्टर श्रृंखला के क्रम का अनुसरण करती है:

सर्वाधिक वर्षा $$ \mathrm{ PO_{4}^{3-} > SO_{4}^{2-} > COO^{-} > Cl^{-}}$$ सबसे कम वर्षा

सर्वाधिक वर्षा $$ \mathrm{ NH_{4}^{+} > K^{+} > Na^{+}}$$ सबसे कम वर्षा

व्यवहार में नमक डालना
प्रोटीन घुलनशीलता में कमी दिखाए गए प्रकार के सामान्यीकरण स्थिर घुलनशीलता वक्र का अनुसरण करती है। एक प्रोटीन की विलेयता और विलयन की बढ़ती आयनिक शक्ति के बीच संबंध कोहन समीकरण द्वारा दर्शाया जा सकता है:
 * $$ \log S = B - KI \,$$

S = प्रोटीन की घुलनशीलता, B आदर्शित घुलनशीलता है, K एक नमक-विशिष्ट स्थिरांक है और I विलयन की आयनिक शक्ति है, जिसे जोड़े गए नमक के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है।

$$ I = \begin{matrix}\frac{1}{2}\end{matrix}\sum_{i=1}^{n} c_{i}z_{i}^{2} $$ साथi नमक और सी का आयन चार्ज हैi नमक की सघनता है। प्रोटीन वर्षा के लिए आदर्श नमक एक विशेष अमीनो एसिड संरचना, सस्ती, गैर-बफरिंग और गैर-प्रदूषणकारी के लिए सबसे प्रभावी है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला नमक अमोनियम सल्फेट है। 0 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस तापमान पर नमक निकालने में कम भिन्नता होती है। नमक के घोल में बचा हुआ प्रोटीन वर्षों तक स्थिर रह सकता है - उच्च नमक सांद्रता द्वारा प्रोटियोलिसिस और जीवाणु संदूषण से सुरक्षित।

समविद्युत अवक्षेपण
समविभव बिंदु (पीआई) एक समाधान का पीएच है जिस पर प्रोटीन का शुद्ध प्राथमिक प्रभार शून्य हो जाता है। एक समाधान पीएच में जो पीआई से ऊपर है, प्रोटीन की सतह मुख्य रूप से नकारात्मक रूप से चार्ज होती है और इसलिए चार्ज किए गए अणु प्रतिकारक शक्तियों का प्रदर्शन करेंगे। इसी तरह, एक समाधान पीएच पर जो पीआई से नीचे है, प्रोटीन की सतह मुख्य रूप से सकारात्मक रूप से चार्ज होती है और प्रोटीन के बीच प्रतिकर्षण होता है। हालांकि, पीआई पर नकारात्मक और सकारात्मक चार्ज रद्द हो जाते हैं, प्रतिकारक इलेक्ट्रोस्टैटिक बल कम हो जाते हैं और आकर्षण बल प्रबल हो जाते हैं। आकर्षण बल एकत्रीकरण और वर्षा का कारण बनेंगे। अधिकांश प्रोटीन का पीआई 4-6 की पीएच श्रेणी में होता है। हाइड्रोक्लोरिक और सल्फ्यूरिक एसिड जैसे खनिज एसिड अवक्षेपक के रूप में उपयोग किए जाते हैं। आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट वर्षा का सबसे बड़ा नुकसान खनिज एसिड के कारण होने वाली अपरिवर्तनीय विकृतीकरण (जैव रसायन) है। इस कारण से लक्ष्य प्रोटीन के बजाय आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु वर्षा का उपयोग अक्सर दूषित प्रोटीनों को अवक्षेपित करने के लिए किया जाता है। चीज़ बनाने के दौरान या सोडियम केसिनेट के उत्पादन के दौरान कैसिइन का अवक्षेपण एक समविद्युत अवक्षेपण है।

गलत सॉल्वैंट्स के साथ वर्षा
मिश्रणीय सॉल्वैंट्स जैसे कि इथेनॉल या मेथनॉल को एक घोल में मिलाने से घोल में प्रोटीन अवक्षेपित हो सकता है। प्रोटीन के चारों ओर सॉल्वैंशन परत कम हो जाएगी क्योंकि कार्बनिक विलायक उत्तरोत्तर प्रोटीन की सतह से पानी को विस्थापित करता है और इसे कार्बनिक विलायक अणुओं के चारों ओर जलयोजन परतों में बांधता है। छोटी जलयोजन परतों के साथ, प्रोटीन आकर्षक इलेक्ट्रोस्टैटिक और द्विध्रुवीय बलों द्वारा एकत्रित हो सकते हैं। तापमान पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं, जो समाधान में विकार (जैव रसायन), पीएच और प्रोटीन एकाग्रता से बचने के लिए 0 डिग्री सेल्सियस से कम होना चाहिए। घुलनशील कार्बनिक सॉल्वैंट्स पानी के ढांकता हुआ स्थिरांक को कम करते हैं, जो प्रभाव में दो प्रोटीनों को एक साथ आने की अनुमति देता है। आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु पर ढांकता हुआ स्थिरांक और प्रोटीन घुलनशीलता के बीच संबंध निम्न द्वारा दिया जाता है:
 * $$ \log S = k/e^{2} + \log S^{0} \,$$

एस0 S का बहिर्वेशित मान है, e मिश्रण का परावैद्युतांक है और k वह नियतांक है जो पानी के परावैद्युतांक से संबंधित है। प्लाज्मा प्रोटीन विभाजन के लिए Cohn प्रक्रिया व्यक्तिगत प्लाज्मा प्रोटीन को अलग करने के लिए इथेनॉल के साथ विलायक अवक्षेपण पर निर्भर करती है।

बिलीरुबिन के अनुमान में एक प्रोटीन अवक्षेपक एजेंट के रूप में मेथनॉल के उपयोग के लिए एक नैदानिक ​​अनुप्रयोग है।

गैर-आयनिक हाइड्रोफिलिक पॉलिमर
पॉलिमर, जैसे कि dextrans  और पॉलीथीन ग्लाइकॉल, अक्सर प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं क्योंकि उनकी ज्वलनशीलता कम होती है और आइसोइलेक्ट्रिक वर्षा की तुलना में बायोमैटेरियल्स को विकृत करने की संभावना कम होती है। समाधान में ये पॉलिमर पानी के अणुओं को प्रोटीन के चारों ओर सॉल्वेशन परत से दूर आकर्षित करते हैं। यह प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को बढ़ाता है और वर्षा को बढ़ाता है। पॉलीथीन ग्लाइकोल के विशिष्ट मामले के लिए, समीकरण द्वारा वर्षा का मॉडल तैयार किया जा सकता है:
 * $$ \ln(S) + pS = X - aC \,$$

सी बहुलक एकाग्रता है, पी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन गुणांक है, प्रोटीन-पॉलिमर इंटरैक्शन गुणांक है और


 * $$ x = (\mu_i - \mu_i^{0})RT $$

μ घटक I की रासायनिक क्षमता है, R सार्वभौमिक गैस स्थिरांक है और T पूर्ण तापमान है।

पोलीइलेक्ट्रोलाइट्स द्वारा फ्लोकुलेशन
Alginate, carboxymethylcellulose, polyacrylic acid, tannic acid और polyphosphates समाधान में प्रोटीन अणुओं के बीच विस्तारित नेटवर्क बना सकते हैं। इन पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स की प्रभावशीलता समाधान के पीएच पर निर्भर करती है। आयनिक पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स का उपयोग आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु से कम पीएच मान पर किया जाता है। Cationic polyelectrolytes pI के ऊपर pH मान पर हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स की अधिकता अवक्षेप को घोल में वापस घुलने का कारण बनेगी। पॉलीइलेक्ट्रोलाइट फ्लोक्यूलेशन का एक उदाहरण खस्ता खोल का उपयोग करके बीयर वोर्ट से प्रोटीन क्लाउड को हटाना है।

बहुसंयोजक धात्विक आयन
विलयनों से एंजाइमों और न्यूक्लिक अम्लों को अवक्षेपित करने के लिए धातु के लवणों का उपयोग कम सांद्रता में किया जा सकता है। अक्सर उपयोग किए जाने वाले बहुसंयोजी धातु आयन सीए होते हैं2+, एमजी2+, मिलियन2+ या फ़े2+.

वर्षा रिएक्टर
बड़ी मात्रा में प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग किए जाने की तुलना में कई औद्योगिक स्केल रिएक्टर हैं, जैसे कि एक समाधान से पुनः संयोजक डीएनए पोलीमरेज़।

बैच रिएक्टर
बैच रिएक्टर वर्षा रिएक्टर का सबसे सरल प्रकार है। मिश्रण के तहत अवक्षेपण एजेंट को धीरे-धीरे प्रोटीन समाधान में जोड़ा जाता है। एकत्रित प्रोटीन कण आकार में कॉम्पैक्ट और नियमित होते हैं। चूंकि कण लंबे समय तक कतरनी तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला के संपर्क में आते हैं, इसलिए वे कॉम्पैक्ट, घने और यांत्रिक रूप से स्थिर होते हैं।

ट्यूबलर रिएक्टर
ट्यूबलर रिएक्टरों में, फ़ीड प्रोटीन समाधान और अवक्षेपण अभिकर्मक को कुशल मिश्रण के क्षेत्र में संपर्क किया जाता है, फिर लंबी ट्यूबों में खिलाया जाता है जहां वर्षा होती है। वॉल्यूम तत्वों में तरल पदार्थ प्लग प्रवाह तक पहुंचता है क्योंकि वे रिएक्टर की ट्यूबों के माध्यम से चलते हैं। ट्यूब में तार जाल आवेषण के माध्यम से अशांत प्रवाह को बढ़ावा दिया जाता है। ट्यूबलर रिएक्टर को चलने वाले यांत्रिक भागों की आवश्यकता नहीं होती है और यह निर्माण के लिए सस्ती है। हालांकि, रिएक्टर अव्यावहारिक रूप से लंबा हो सकता है यदि कण धीरे-धीरे एकत्रित होते हैं।

सतत उभारा टैंक रिएक्टर (CSTR)
निरंतर उभारा-टैंक रिएक्टर मॉडल रिएक्टर एक अच्छी तरह से मिश्रित टैंक में अभिकारकों और उत्पादों के निरंतर प्रवाह के साथ स्थिर अवस्था में चलते हैं। ताजा प्रोटीन फ़ीड संपर्क घोल जिसमें पहले से ही अवक्षेपित कण और वर्षा अभिकर्मक होते हैं।

संदर्भ

 * Harrison et al., Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press. New York, NY 2003.
 * Shuler et al., Bioprocess Engineering: Basic Concepts (2nd Edition). Prentice Hall International. 2001
 * Ladisch. Bioseparations Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 2001.
 * Lydersen. Bioprocess Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1994.
 * Belter, Paul A. Bioseparations: downstream processing for biotechnology. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1988.
 * Belter, Paul A. Bioseparations: downstream processing for biotechnology. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1988.