सेंगर अनुक्रमण

सेंगर अनुक्रमण डीएनए अनुक्रमण की एक ऐसी विधि है जिसमें वैद्युतकणसंचलन सम्मिलित है और पात्रे डीएनए प्रतिकृति के समय डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा श्रृंखला समापन डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड के यादृच्छिक समावेश पर आधारित है। 1977 में पहली बार फ्रेडरिक सिंगर और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किए जाने के बाद, यह लगभग 40 वर्षों के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली अनुक्रमण विधि बन गई। इसका पहली बार 1986 में अनुप्रयुक्त जैवतंत्र द्वारा व्यावसायीकरण किया गया था। वर्तमान में, उच्च मात्रा सेंगर अनुक्रमण को अगली पीढ़ी के विधियों अनुक्रमण विधियों द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर, स्वचालित संजीन विश्लेषण के लिए किया गया है। यद्यपि, छोटे पैमाने की परियोजनाओं के लिए और गहन अनुक्रमण परिणामों के सत्यापन के लिए सेंगर विधि व्यापक उपयोग में बनी हुई है। यह अभी भी लघु पठन अनुक्रमण तकनीकों (जैसे इल्लुमिना) पर लाभ है कि यह डीएनए अनुक्रम पठन> 500 न्यूक्लियोटाइड का उत्पादन कर सकते है और लगभग 99.99% यथार्थता के साथ बहुत कम त्रुटि दर बनाए रखते है। सार्स-सीओवी-2 से स्पाइक प्रोटीन के अनुक्रमण के साथ-साथ रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) कैलिसीनेट सर्वेक्षण नेटवर्क के माध्यम से नोरोविषाणु के प्रकोप की सर्वेक्षण के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रस्ताव के प्रयासों में सेंगर अनुक्रमण अभी भी सक्रिय रूप से उपयोग किया जा रहा है।

विधि
शास्त्रीय श्रृंखला-समापन विधि के लिए एकल- गुंफित डीएनए रूपदा, एक डीएनए उपक्रामक (आणविक जीव विज्ञान), एक डीएनए पोलीमरेज़, सामान्य डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी), और संशोधित डी-डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीडीएनटीपी) की आवश्यकता होती है, जिनमें से बाद में डीएनए गुंफित दीर्घीकरण समाप्त हो जाते है। इन श्रृंखला समापन न्यूक्लियोटाइड में दो न्यूक्लियोटाइड के बीच फॉस्फोडाइएस्टर बंधन के गठन के लिए आवश्यक 3'- हाइड्रॉकसिल समूह की कमी होती है, जिससे डीएनए पोलीमरेज़ डीएनए के विस्तार को समाप्त कर देते है जब एक संशोधित डीडीएनटीपी सम्मिलित होते है। स्वचालित अनुक्रमण मशीनों में पता लगाने के लिए डीडीएनटीपी को रेडियोधर्मी या प्रतिदीप्ति रूप से लेबल किया जा सकता है।

डीएनए प्रतिदर्श को चार अलग-अलग अनुक्रमण अभिक्रियाओं में विभाजित किया गया है, जिसमें सभी चार मानक डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड-ट्राइफॉस्फेट (डीएटीपी, डीजीटीपी, डीसीटीपी और डीटीटीपी) और डीएनए पोलीमरेज़ सम्मिलित हैं। प्रत्येक अभिक्रिया में मात्र चार डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड (डीडीएटीपी, डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी, या डीडीटीटीपी) में से एक जोड़ा जाता है, जबकि अन्य जोड़े गए न्यूक्लियोटाइड सामान्य होते हैं। डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड सांद्रता संबंधित डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड (जैसे 0.5मिमी डीटीटीपी: 0.005मिमी डीडीटीटीपी) की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक होनी चाहिए ताकि पूर्ण अनुक्रम का प्रतिलेखन करते समय पर्याप्त अंशों का उत्पादन किया जा सके (परन्तु डीडीएनटीपी की एकाग्रता अनुक्रम की वांछित लंबाई पर भी निर्भर करती है)। इसे और अधिक संवेदी क्रम में रखते हुए, इस प्रक्रिया में सभी चार डीडीएनटीपी का परीक्षण करने के लिए चार अलग-अलग अभिक्रियाओं की आवश्यकता होती है। बाध्य उपक्रामक से रूपदा डीएनए विस्तार के आवर्तन के बाद, परिणामी डीएनए खंड ऊष्मा डीएनए विकृतीकरण होते हैं और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके आकार से अलग होते हैं। 1977 के मूल प्रकाशन में, एसएसडीएनए के आधार-युग्मित पाश का गठन कुछ स्थानों पर बैंड को हल करने में गंभीर कठिनाई का कारण था। यह प्रायः चार अलग-अलग लेन (लेन ए, टी, जी, सी) में से एक में चलने वाली चार अभिक्रियाओं में से प्रत्येक के साथ विकृतीयन पॉलीएक्रिलामाइड जेल-यूरिया जेल का उपयोग करके किया जाता है। फिर स्वतः रेडियोलेखन या यूवी प्रकाश द्वारा डीएनए बैंड की कल्पना की जा सकती है, और डीएनए अनुक्रम को रेडियोलेखन या जेल प्रतिरूप से सीधे पढ़ा जा सकता है। दाईं ओर की प्रतिरूप में, रेडियोलेखन को जेल के संपर्क में लाया गया था, और अदीप्त बैंड विभिन्न लंबाई के डीएनए अंशों के अनुरूप हैं। एक लेन में अदीप्त बैंड डीएनए खंड को इंगित करता है जो कि डाइडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड (डीडीएटीपी, डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी, या डीडीटीटीपी) के समावेश के बाद श्रृंखला समाप्ति का परिणाम है। फिर नीचे से ऊपर तक चार लेन के बीच विभिन्न बैंडों की सापेक्ष स्थिति का उपयोग डीएनए अनुक्रम को पढ़ने के लिए किया जाता है।

श्रृंखला-समाप्ति अनुक्रमण की तकनीकी विविधताओं में समस्थानिक लेबलन के लिए रेडियोधर्मी फॉस्फोरस युक्त न्यूक्लियोटाइड के साथ टैगन, या प्रतिदीप्ति रंजक के साथ 5' छोर पर लेबल किए गए उपक्रामक का उपयोग करना सम्मिलित है। रंजक-उपक्रामक अनुक्रमण तीव्रता से और अधिक मितिव्ययी विश्लेषण और स्वचालन के लिए प्रकाशिक तंत्र में पढ़ने की सुविधा प्रदान करते है। लेरॉय हुड और सहकर्मियों द्वारा बाद में विकास प्रतिदीप्त लेबल किए गए डीडीएनटीपी और उपक्रामक ने स्वचालित, उच्च-साद्यांत डीएनए अनुक्रमण के लिए स्तर तैयार किया।श्रृंखला-समाप्ति विधियों ने डीएनए अनुक्रमण को बहुत सरल बना दिया है। उदाहरण के लिए, श्रृंखला-समापन-आधारित किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं जिनमें अनुक्रमण के लिए आवश्यक अभिकर्मक, पूर्व-विभाज्य और उपयोग के लिए तैयार हैं। सीमाओं में डीएनए के लिए उपक्रामक का गैर-विशिष्ट बंधन सम्मिलित है, जो डीएनए अनुक्रम के यथार्थ पठन दर्श को प्रभावित करते है, और डीएनए माध्यमिक संरचनाएं अनुक्रम की निष्ठा को प्रभावित करती हैं।

रंजक-समापक अनुक्रमण
रंजक-समापक अनुक्रमण श्रृंखला समापक डीडीएनटीपी की लेबलन का उपयोग करते है, जो लेबल-उपक्रामक विधि के अनुसार चार अभिक्रियाओं के अतिरिक्त एकल अभिक्रिया में अनुक्रमण की अनुमति देते है। रंजक-समापक अनुक्रमण में, चार डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला समापकों में से प्रत्येक को प्रतिदीप्त रंजक के साथ लेबल किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश का उत्सर्जन करते है।

इसकी अधिक समीचीनता और गति के कारण, रंजक-समापक अनुक्रमण अब स्वचालित अनुक्रमण में मुख्य आधार है। इसकी सीमाओं में रंजक-लेबल वाले श्रृंखला समापकों को डीएनए के खंड में सम्मिलित करने में अंतर के कारण रंजक प्रभाव सम्मिलित हैं, जिसके परिणामस्वरूप केशिका वैद्युतकणसंचलन के बाद इलेक्ट्रॉनिक डीएनए अनुक्रम अनुरेखण वर्णलेख में असमान शिखर की ऊंचाई और आकार होते हैं (बाईं ओर आंकड़ा देखें)।

इस समस्या को संशोधित डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम प्रणाली और रंगों के उपयोग से संबोधित किया गया है जो निगमन परिवर्तनशीलता को कम करते हैं, साथ ही रंजक बूँद को समाप्त करने के विधि भी। रंजक-समापक अनुक्रमण विधि, स्वचालित उच्च-साद्यांत डीएनए अनुक्रम विश्लेषक के साथ, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की प्रारम्भ तक अनुक्रमण परियोजनाओं के विशाल बहुमत के लिए उपयोग की गई थी।

स्वचालन और प्रतिदर्श तैयार करना
स्वचालित डीएनए-अनुक्रमण उपकरण (डीएनए अनुक्रमक) एक बैच में 384 डीएनए प्रतिदर्शों तक का अनुक्रम कर सकते हैं। बैच रन दिन में 24 बार तक हो सकते हैं। केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके डीएनए अनुक्रमक आकार (या लंबाई) द्वारा गुंफित अलग करते हैं, वे रंजक प्रतिदीप्ति का पता लगाते हैं और रिकॉर्ड करते हैं, और प्रतिदीप्त शीर्ष अनुरेखण वर्णलेख के रूप में आउटपुट डेटा। अनुक्रमक पर प्रतिदर्श लोड करने से पहले, उभयरोधी विलयन में प्रतिदर्श की अनुक्रमण अभिक्रिया (थर्मोसाइक्लर और लेबलन), परिशोधन और प्रतिदर्श का पुनर्निलंबन अलग से किया जाता है। कई वाणिज्यिक और गैर-वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर पैकेज निम्न-गुणवत्ता वाले डीएनए निशानों को स्वचालित रूप से ट्रिम कर सकते हैं। ये प्रोग्राम प्रत्येक शिखर के गुणवत्ता की गणना करते हैं और निम्न-गुणवत्ता वाले आधार शीर्षों को हटाते हैं (जो सामान्यतः अनुक्रम के अंत में स्थित होते हैं)। ऐसे एल्गोरिदम की यथार्थता मानव प्रचालक द्वारा दृश्य परीक्षा से कम है, परन्तु बड़े अनुक्रम डेटा समूहों के स्वचालित प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त है।

रंजक-अंतस्थ अनुक्रमण के अनुप्रयोग
सार्वजनिक स्वास्थ्य का क्षेत्र रोगी निदान के साथ-साथ संभावित विषाक्त पदार्थों की पर्यावरणीय सर्वेक्षण और जैविक रोगजनकों को प्रसारित करने में कई भूमिकाएँ निभाते है। सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं (पीएचएल) और संसार की अन्य प्रयोगशालाओं ने कोरोना-19 के रोगकारक सार्स-सीओवी-2 विषाणु के सर्वेक्षण के लिए तीव्रता से अनुक्रमण डेटा प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, महामारी जिसे 30 जनवरी, 2020 को सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकाल घोषित किया गया था। प्रयोगशालाओं को अनुक्रमण विधियों के तीव्रता से कार्यान्वयन का कार्य दिया गया था और विषाणु के प्रसार को कम करने के लिए नीतियों के विकास के लिए निर्णय लेने वाले मॉडल में सहायता के लिए यथार्थ डेटा प्रदान करने के लिए कहा गया था। कई प्रयोगशालाओं ने अगली पीढ़ी की अनुक्रमण पद्धतियों का शरण लिया जबकि अन्य ने सेंगर अनुक्रमण के प्रयासों का समर्थन किया। सार्स-सीओवी-2 के अनुक्रमण प्रयास कई हैं, जबकि अधिकांश प्रयोगशालाओं ने विषाणु के पूरे संजीन अनुक्रमण को लागू किया है, अन्य ने विषाणु के बहुत विशिष्ट जीन जैसे एस-जीन को अनुक्रमित करने का विकल्प चुना है, जो स्पाइक प्रोटीन के उत्पादन के लिए आवश्यक जानकारी को विकोडन करते है। सार्स-सीओवी-2 की उच्च उत्परिवर्तन दर एस-जीन के भीतर आनुवंशिक अंतर की ओर ले जाती है और इन अंतरों ने विषाणु की संक्रामकता में भूमिका निभाई है। एस-जीन का सेंगर अनुक्रमण आनुवंशिक कोड को पुनः प्राप्त करने के लिए एक त्वरित, यथार्थ और अधिक मितिव्ययी विधि प्रदान करते है। कम आय वाले देशों में प्रयोगशालाओं में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसे बहुमूल्य अनुप्रयोगों को लागू करने की क्षमता नहीं हो सकती है, इसलिए परिवर्ती के सर्वेक्षण के लिए अनुक्रमण डेटा की पीढ़ी के समर्थन में सेंगर विधियाँ प्रबल हो सकती हैं।

रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) कैलिसीनेट नेटवर्क के लिए नोरोविषाणु सर्वेक्षण विधियों के लिए सेंगर अनुक्रमण भी स्वर्ण मानक है। कालकिनेट एक प्रकोप सर्वेक्षण नेटवर्क है जिसे मार्च 2009 में स्थापित किया गया था। नेटवर्क का लक्ष्य संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रसारित नोरोविषाणु के अनुक्रमण डेटा एकत्र करना और विषाणु के प्रसार को कम करने के लिए संक्रमण के स्रोत को निर्धारित करने के लिए अनुप्रवाह क्रिया को सक्रिय करना है। कालकिनेट नेटवर्क ने खाद्य जनित बीमारियों के रूप में कई संक्रमणों की पहचान की है। इस डेटा को तब प्रकाशित किया जा सकता है और भोजन को दूषित होने से बचाने के लिए भविष्य की क्रिया के लिए संस्तुति विकसित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। नोरोविषाणु का पता लगाने के लिए नियोजित विधियों में संजीन के विशिष्ट क्षेत्रों का लक्षित प्रवर्धन सम्मिलित है। एम्पलीकॉन्स को तब रंजक-अंतस्थ सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है और उत्पन्न वर्णलेख और अनुक्रमों का जैवबायोअंकीय में विकसित एक सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ विश्लेषण किया जाता है। अनुक्रमों को ट्रैक किया जाता है और महामारी संबंधी प्रासंगिकता का अनुमान लगाने के लिए तनाव संबंधीता का अध्ययन किया जाता है।

आह्वान
सेंगर पद्धति के साथ डीएनए अनुक्रमण की सामान्य आह्वानों में उपक्रामक बंधक के कारण अनुक्रम के पहले 15-40 आधारों में दूषित गुणवत्ता और 700-900 आधारों के बाद अनुक्रमण निशान की बिगड़ती गुणवत्ता सम्मिलित है। आधार कॉलिंग सॉफ़्टवेयर जैसे फ्रेड (सॉफ़्टवेयर) सामान्यतः अनुक्रमों के निम्न-गुणवत्ता वाले क्षेत्रों को ट्रिमन करने में सहायता करने के लिए गुणवत्ता का अनुमान प्रदान करते है।

ऐसी स्थितियों में जहां डीएनए अंशों को अनुक्रमण से पहले क्लोन किया जाता है, परिणामी अनुक्रम में क्लोनकारी संवाहक के भाग सम्मिलित हो सकते हैं। इसके विपरीत आग्निकअनुक्रमण पर आधारित पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया- क्लोनकारी और अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकें प्रायः क्लोनकारी संवाहक का उपयोग करने से बचती हैं। वर्तमान में, एक-चरणीय सेंगर अनुक्रमण (संयुक्त प्रवर्धन और अनुक्रमण) विधियों जैसे एम्प्लिसेक और सेक्शार्प विकसित किए गए हैं जो क्लोनकारी या पूर्व प्रवर्धन के बिना लक्ष्य जीनों की तीव्र अनुक्रमण की अनुमति देते हैं।

वर्तमान विधि मात्र एक अभिक्रिया में मात्र अपेक्षाकृत कम (300-1000 न्यूक्लियोटाइड लंबे) डीएनए अंशों को अनुक्रमित कर सकते हैं। इस आकार सीमा से ऊपर के डीएनए अंशों के अनुक्रमण में मुख्य बाधा बड़े डीएनए अंशों को हल करने के लिए पृथक्करण की अपर्याप्त शक्ति है जो मात्र एक न्यूक्लियोटाइड द्वारा लंबाई में भिन्न होती है।

सूक्ष्मप्रवाही सेंगर अनुक्रमण
सूक्ष्मप्रवाही सेंगर अनुक्रमण डीएनए अनुक्रमण के लिए एक प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप अनुप्रयोग है, जिसमें सेंगर अनुक्रमण चरण (ऊष्मीय चक्रण, प्रतिदर्श शुद्धिकरण, और केशिका वैद्युतकणसंचलन) को नैनोलिटर-स्तर प्रतिदर्श मात्रा का उपयोग करके वेफर-स्तर चिप पर एकीकृत किया जाता है। सेंगर अनुक्रमण चरणों को एकीकृत और स्वचालित करके पारंपरिक सेंगर विधि (जैसे बहुमूल्य अभिकर्मकों की उच्च खपत, बहुमूल्य उपकरणों पर निर्भरता, कार्मिक-गहन प्रकलन, आदि) की कई महत्वपूर्ण कमियों को दूर करते हुए, यह तकनीक लंबी और यथार्थ अनुक्रम पढ़ती है।.

अपनी आधुनिक स्थापना में, उच्च-साद्यांत संजीन अनुक्रमण में संजीन को छोटे एकल- गुंफित टुकड़ों में विभाजित करना सम्मिलित है, इसके बाद पोलीमरेज़ श्रृंखला अभिक्रिया (पीसीआर) द्वारा टुकड़ों का प्रवर्धन किया जाता है। सेंगर विधि को अपनाते हुए, प्रत्येक डीएनए टुकड़ा अपरिवर्तनीय रूप से प्रतिदीप्तिशील लेबल वाले द्विविऑक्सी श्रृंखला समापन न्यूक्लियोटाइड के समावेश के साथ समाप्त हो जाते है, जिससे टुकड़ों का एक डीएनए "सोपान" बनते है जो प्रत्येक लंबाई में आधार से भिन्न होते है और अंतक आधार पर आधार-विशिष्ट प्रतिदीप्त लेबल को रखते है। प्रवर्धित आधार सोपान को तब केशिका सरणी वैद्युतकणसंचलन (सीएई) द्वारा स्वचालित रूप से अलग किया जाता है, प्रतिदीप्तिशील लेबल वाले एसएसडीएनए अंशों की " समापन रेखा" पहचान में, जो अंशों का एक क्रमबद्ध क्रम प्रदान करते है। इन अनुक्रमों को पढ़ा जाता है, फिर कंप्यूटर को अतिव्यापी या सन्निहित अनुक्रमों (जिसे संदर्भ कहा जाता है) में एकत्रित किया जाता है, जो एक बार पूर्ण रूप से एकत्रित होने पर पूर्ण संजीनी अनुक्रम जैसा दिखते है।

सेंगर विधियाँ लगभग 800 बीपी की अधिकतम पठन लंबाई प्राप्त करती हैं (सामान्यतः गैर-समृद्ध डीएनए के साथ 500-600 बीपी)। सेंगर विधियों में लंबे समय तक पढ़ी जाने वाली लंबाई अन्य अनुक्रमण विधियों पर विशेष रूप से संजीन के दोहराए जाने वाले क्षेत्रों के अनुक्रमण के संदर्भ में महत्वपूर्ण लाभ प्रदर्शित करती है। लघु पठन अनुक्रमण डेटा की एक आह्वान विशेष रूप से नवीन संजीन (डे नोवो) के अनुक्रमण में और अत्यधिक पुनर्व्यवस्थित संजीन खंडों के अनुक्रमण में एक समस्या है, सामान्यतः कैंसर संजीन या गुणसूत्रों के क्षेत्रों में जो संरचनात्मक भिन्नता प्रदर्शित करते हैं।

सूक्ष्मप्रवाही अनुक्रमण तकनीकों के अनुप्रयोग
डीएनए अनुक्रमण के अन्य उपयोगी अनुप्रयोगों में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) का पता लगाना, एकल गुंफित रचना बहुरूपता (एसएससीपी) विषमद्वैध विश्लेषण और लघु अग्रानुक्रम दोहराना (एसटीआर) सम्मिलित हैं। संजीन की इन विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए आकार और/या संरचना में अंतर के अनुसार डीएनए अंशों को हल करना सबसे महत्वपूर्ण चरण है।

युक्ति डिजाइन
अनुक्रमण चिप में एक चार-परत का निर्माण होता है, जिसमें तीन 100-मिमी-व्यास वाले कांच वेफर्स (जिस पर उपकरण तत्व सूक्ष्म संविरचित होते हैं) और एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) झिल्ली होती है। अभिक्रिया कक्षों और केशिका वैद्युतकणसंचलन चैनलों को शीर्ष दो कांच वेफर्स के बीच निक्षारित किया जाता है, जो ऊष्मीय रूप से बंधे होते हैं। पीडीएमएस और तल बहुमुख कांच वेफर द्वारा त्रि-आयामी चैनल अंतःसंबंध और सूक्ष्मवाल्व बनते हैं।

युक्ति में तीन कार्यात्मक इकाइयाँ होती हैं, जिनमें से प्रत्येक सेंगर अनुक्रमण चरणों के अनुरूप होती हैं। ऊष्मीय चक्रण (टीसी) इकाई एक 250-नैनोलिटर अभिक्रिया कक्ष है जिसमें एकीकृत प्रतिरोधक तापमान संसूचक, सूक्ष्मवाल्व और एक सतह तापक है। शीर्ष अधिकतम-कांच परत और निचली कांच-पीडीएमएस परत के बीच अभिकर्मक का संचलन 500-माइक्रोन-व्यास छिद्र के माध्यम होते है। ऊष्मीय चक्रण के बाद, अभिक्रिया मिश्रण प्रग्रहण/शुद्धि कक्ष में शुद्धिकरण से गुजरते है, और फिर केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) कक्ष में अंतःक्षिप्त किया जाता है। सीई इकाई में 30-सेमी केशिका होती है जो 65-माइक्रोन-व्यापक घुमावों के माध्यम से संक्षिप्त स्विचबैक पैटर्न में वलित हो जाती है।

अनुक्रमण रसायन

 * ऊष्मीय चक्रण
 * टीसी अभिक्रिया कक्ष में, रंजक-समापक अनुक्रमण अभिकर्मक, रूपदा डीएनए, और उपक्रामक को टीसी कक्ष और ऊष्मीय चक्रण में लोड किया जाता है। ऊष्मीय चक्र 35 चक्रों के लिए (12 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर और 55 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर)।


 * शुद्धिकरण
 * आवेशित अभिक्रिया मिश्रण (विस्तार खंड, रूपदा डीएनए, और अतिरिक्त अनुक्रमण अभिकर्मक युक्त) प्रग्रहण निर्गम और अंतर्गम पोर्ट के बीच लागू 33-वोल्ट/सेमी विद्युत क्षेत्र के माध्यम से 30 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रग्रहण/शुद्धि कक्ष के माध्यम से आयोजित किया जाता है। प्रग्रहण जेल जिसके माध्यम से प्रतिदर्श संचालित होता है, में 40 μM अल्पन्यूक्लियोटाइड (उपक्रामक के पूरक) होते हैं जो सहसंयोजक रूप से एक पॉलीएक्रिलामाइड आव्यूह से बंधे होते हैं। प्रसार के खंड जेल आव्यूह द्वारा स्थिर होते हैं, और अतिरिक्त उपक्रामक, रूपदा, मुक्त न्यूक्लियोटाइड और लवण प्रग्रहण क्षय पोर्ट के माध्यम से निकाले जाते हैं। विस्तार अंशों को मुक्त करने के लिए प्रग्रहण जेल को 67-75 °C तक गर्म किया जाता है।


 * केशिका वैद्युतकणसंचलन
 * विस्तार अंशों को सीई कक्ष में अंतःक्षिप्त किया जाता है जहां उन्हें 125-167-V/cm क्षेत्र के माध्यम से वैद्युत कण संचलन किया जाता है।

प्लेटफॉर्म
अपोलो 100 प्लेटफॉर्म (सूक्ष्मचिप जैवतकनीकी इंक, डबलिन, सीए) पूर्ण रूप से स्वचालित प्रणाली में पहले दो सेंगर अनुक्रमण चरणों (ऊष्मीय चक्रण और शुद्धिकरण) को एकीकृत करते है। निर्माता का अनुरोध है कि प्रतिदर्श के तीन घंटे के भीतर केशिका वैद्युतकणसंचलन के लिए तैयार हैं और प्रणाली में अभिकर्मकों को लोड किया जा रहा है। अपोलो 100 प्लेटफॉर्म को अभिकर्मकों के उप-सूक्ष्मलिटर मात्रा की आवश्यकता होती है।

अन्य अनुक्रमण तकनीकों की तुलना
उच्च-साद्यांत अनुक्रमण का अंतिम लक्ष्य उन प्रणालियों को विकसित करना है जो कम लागत वाली हैं, और विस्तारित (लंबी) पढ़ने की लंबाई प्राप्त करने में अत्यंत कुशल हैं। प्रत्येक एकल वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण की लंबी लंबाई, डे नोवो डीएनए अनुक्रमण से जुड़ी लागत को मूलत: कम कर देती है और किसी दिए गए अतिरेक पर डीएनए संदर्भ को अनुक्रमित करने के लिए आवश्यक रूपदा की संख्या को कम कर देती है। सूक्ष्मप्रवाही तीव्र, अल्पमूल्य और सरल अनुक्रम समन्वायोजन की अनुमति दे सकते है।

यह भी देखें

 * दूसरी पीढ़ी अनुक्रमण
 * तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण

बाहरी संबंध

 * MBI Says New Tool That Automates Sanger Sample Prep Cuts Reagent and Labor Costs

Sanger-Methode