आकार अपवर्जन वर्णलेखन

आकार अपवर्जन वर्णलेखन (एसईसी), जिसे आणविक छलनी वर्णलेखन के रूप में भी जाना जाता है, एक वर्णलेखन विधि है जिसमें विलयन (रसायन विज्ञान) में अणुओं को उनके आकार और कुछ स्थितियों में आणविक भार से अलग किया जाता है। यह सामान्यतः बड़े अणुओं या  बृहदाण्विक सम्मिश्रण जैसे प्रोटीन और औद्योगिक पॉलिमर पर लागू होता है। सामान्यतः, जब एक जलीय घोल का उपयोग स्तंभ के माध्यम से प्रतिदर्श को ले जाने के लिए किया जाता है, तो तकनीक को जेल-निस्पंदन वर्णलेखन के रूप में जाना जाता है, बनाम नाम जेल निस्पंदन वर्णलेखन, जिसका उपयोग तब किया जाता है जब एक कार्बनिक विलायक को  गतिशील प्रावस्था के रूप में उपयोग किया जाता है। वर्णलेखन स्तंभ महीन, झरझरा मोतियों से भरा होता है जो सामान्यतः   डेक्स्ट्रान , एगारोस या   पॉलिएक्रिलैमाइड पॉलिमर से बना होता है।  बृहद् अणु  के आयामों का अनुमान लगाने के लिए इन मोतियों के छिद्रों के आकार का उपयोग किया जाता है। एसईसी एक व्यापक रूप से उपयोग  किया जाने वाला बहुलक लक्षण वर्णन विधि है, क्योंकि इसकी पॉलिमर के लिए अच्छे  ग्राम अणुक द्रव्यमान वितरण (Mw) परिणाम प्रदान करने की क्षमता है।

अनुप्रयोग
आकार अपवर्जन वर्णलेखन का मुख्य अनुप्रयोग प्रोटीन और अन्य जल में घुलनशील पॉलिमर का विभाजन है, जबकि जेल पारगमन वर्णलेखन का उपयोग कार्बनिक-घुलनशील पॉलिमर के आणविक भार वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। किसी भी तकनीक को जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए, जहां एक विद्युत क्षेत्र का उपयोग अणुओं को उनके विद्युत आवेशों के आधार पर जेल के माध्यम से खींचने के लिए किया जाता है। किसी छिद्र के भीतर विलेय के रहने की मात्रा, छिद्र के आकार पर निर्भर करती है। बड़े विलेय की एक छोटी मात्रा तक पहुंच होगी और इसके विपरीत। इसलिए, बड़े विलेय की तुलना में एक छोटा विलेय लंबे समय तक छिद्र के भीतर रहेगा।

आकार अपवर्जन वर्णलेखन का एक अन्य उपयोग जल में प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ की स्थिरता और विशेषताओं की जांच करना है। इस पद्धति में, मार्गिट बी. मुलर, डैनियल श्मिट, और फ्रिट्ज़ एच. फ्रिमेल ने संसार के विभिन्न स्थानों से जल के स्रोतों का परीक्षण किया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ समय के साथ कितना स्थिर है।  यद्यपि प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थों का अध्ययन करने के लिए आकार अपवर्जन वर्णलेखन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, इसकी सीमाएँ हैं। इन सीमाओं में से एक में यह सम्मिलित  है कि कोई मानक आणविक भार  चिह्नक नहीं है; यदि वास्तविक आणविक भार की आवश्यकता होती है, तो अन्य विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए।

लाभ
इस पद्धति के लाभों में छोटे अणुओं से बड़े अणुओं का अच्छा पृथक्करण सम्मिलित है, जिसमें न्यूनतम आयतन होता है, और विभिन्न विलयनों को निस्पंदन प्रक्रिया में हस्तक्षेप किए बिना लागू किया जा सकता है, सभी कणों की जैविक गतिविधि को अलग करने के लिए संरक्षित करते हुए। तकनीक सामान्यतः दूसरों के साथ संयुक्त होती है जो कुछ यौगिकों के लिए अम्लता, मूलता, आवेश और बंधुता  जैसी अन्य विशेषताओं द्वारा अणुओं को अलग करती है। आकार अपवर्जन वर्णलेखन के साथ, कम और ठीक रूप  से परिभाषित पृथक्करण समय और संकीर्ण बैंड होते हैं, जिससे अच्छी संवेदनशीलता होती है। कोई प्रतिदर्श हानि भी नहीं है क्योंकि विलेय स्थिर प्रावस्था के साथ परस्पर क्रिया नहीं करते हैं।

इस प्रायोगिक विधि का अन्य लाभ यह है कि कुछ स्थितियों में, यौगिक के अनुमानित आणविक भार को निर्धारित करना संभव है। यौगिक (एलुएंट) का आकार और आकार यह निर्धारित करता है कि यौगिक जेल (स्थिर प्रावस्था) के साथ कैसे संपर्क करता है। अनुमानित आणविक भार निर्धारित करने के लिए, उनके संबंधित आणविक भार वाले यौगिकों के रेफरेंस वॉल्यूम प्राप्त किए जाते हैं और फिर "के" का एक प्लॉटav"बनाम" लॉग (मेगावाट)" बनाया गया है, जहां $$K_{av} = (V_e-V_o)/(V_t-V_o)$$और Mw आणविक द्रव्यमान है। यह प्लॉट अंशांकन वक्र के रूप में कार्य करता है, जिसका उपयोग वांछित यौगिक के आणविक भार को अनुमानित करने के लिए किया जाता है। वीe घटक उस आयतन का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर मध्यवर्ती अणु इलूट करते हैं जैसे अणु जिनकी स्तंभ के मनकों तक आंशिक पहुंच होती है। इसके अलावा, वीt मनकों के बीच के कुल आयतन और मनकों के भीतर के आयतन का योग होता है। वीo घटक उस मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर बड़े अणु एल्यूट करते हैं, जो शुरुआत में एल्यूट होता है। नुकसान हैं, उदाहरण के लिए, केवल एक सीमित संख्या में बैंड को समायोजित किया जा सकता है क्योंकि क्रोमेटोग्राम का समय स्केल छोटा है, और सामान्य तौर पर, एक अच्छा संकल्प प्राप्त करने के लिए आणविक द्रव्यमान में 10% अंतर होना चाहिए।

डिस्कवरी
इस तकनीक का आविष्कार 1955 में ग्रांट हेनरी लेथ और कॉलिन आर रूथवेन द्वारा किया गया था, जो क्वीन चार्लोट्स हॉस्पिटल, लंदन में काम कर रहे थे। इस आविष्कार के लिए उन्हें बाद में जॉन स्कॉट पुरस्कार मिला। जबकि लेथ और रूथवेन ने मैट्रिक्स के रूप में स्टार्च जैल का उपयोग  किया, जर्कर पोरथ और  प्रति फ्लोडिन  ने बाद में डेक्सट्रान जैल पेश किया; आकार के विभाजन गुणों वाले अन्य जैल में agarose और  पॉलिएक्रिलैमाइड  सम्मिलित  हैं। इन घटनाक्रमों की एक संक्षिप्त समीक्षा सामने आई है। सिंथेटिक उच्च पॉलिमर को अलग करने का भी प्रयास किया गया; हालांकि, यह 1964 तक नहीं था, जब डॉव केमिकल कंपनी के जे.सी. मूर ने नियंत्रित ताकना आकार के साथ क्रॉस-लिंक्ड POLYSTYRENE पर आधारित जेल परमिट वर्णलेखन (जीपीसी) स्तंभ की तैयारी पर अपना काम प्रकाशित किया था, कि इस क्षेत्र में अनुसंधान गतिविधियों में तेजी से वृद्धि शुरू हुई। यह लगभग तुरंत पहचाना गया कि उचित अंशांकन के साथ, GPC सिंथेटिक पॉलिमर के लिए ग्राम अणुक द्रव्यमान और  ग्राम अणुक द्रव्यमान वितरण जानकारी प्रदान करने में सक्षम था। क्योंकि बाद की जानकारी अन्य तरीकों से प्राप्त करना कठिन था, जीपीसी तेजी से व्यापक उपयोग में आया।

सिद्धांत और विधि
एसईसी मुख्य रूप से प्रोटीन या पॉलिमर जैसे बड़े अणुओं के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। एसईसी adsorbent (स्थिर प्रावस्था) के छिद्रों में छोटे अणुओं को फँसाने का काम करता है। यह प्रक्रिया सामान्यतः एक स्तंभ के भीतर की जाती है, जिसमें सामान्यतः एक खोखली ट्यूब होती है जो माइक्रोन-स्केल पॉलीमर मोतियों से भरी होती है जिसमें विभिन्न आकारों के छिद्र होते हैं। ये छिद्र मनका के माध्यम से सतह या चैनलों पर अवसाद हो सकते हैं। जैसे ही विलयन स्तंभ के नीचे जाता है, कुछ कण छिद्रों में प्रवेश कर जाते हैं। बड़े कण इतने छिद्रों में प्रवेश नहीं कर सकते। कण जितने बड़े होंगे, रेफरेंस उतना ही तेज होगा। बड़े अणु केवल छिद्रों से गुजरते हैं क्योंकि वे अणु छिद्रों में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े होते हैं। इसलिए बड़े अणु छोटे अणुओं की तुलना में अधिक तेज़ी से स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित होते हैं, अर्थात अणु जितना छोटा होता है, अवधारण समय उतना ही अधिक होता है।

एसईसी के लिए एक आवश्यकता यह है कि विश्लेषण स्थिर प्रावस्थाों की सतह के साथ बातचीत नहीं करता है, विश्लेषणों के बीच क्षालन समय में अंतर के साथ आदर्श रूप से विलेय मात्रा पर आधारित होता है, जो स्थिर प्रावस्थाों के साथ रासायनिक या इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के बजाय विश्लेषिकी में प्रवेश कर सकता है। इस प्रकार, एक छोटा अणु जो स्थिर प्रावस्था ताकना प्रणाली के प्रत्येक क्षेत्र में प्रवेश कर सकता है, पूरे ताकना मात्रा और इंटरपार्टिकल वॉल्यूम के योग के बराबर कुल मात्रा में प्रवेश कर सकता है। यह छोटा अणु देर से निकलता है (अणु के सभी छिद्र- और इंटरपार्टिकल वॉल्यूम में प्रवेश करने के बाद - स्तंभ वॉल्यूम का लगभग 80%)। दूसरे चरम पर, एक बहुत बड़ा अणु जो किसी भी छोटे छिद्रों में प्रवेश नहीं कर सकता है, केवल इंटरपार्टिकल वॉल्यूम (स्तंभ वॉल्यूम का ~ 35%) में प्रवेश कर सकता है और जब गतिशील प्रावस्था की यह मात्रा स्तंभ के माध्यम से पारित हो जाती है तो इससे पहले एल्यूट हो जाता है। एसईसी का अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि विभिन्न आकारों के कण अलग-अलग दरों पर एक स्थिर प्रावस्था के माध्यम से रेफरेंस (फ़िल्टर) करते हैं। इसके परिणामस्वरूप आकार के आधार पर कणों का विलयन अलग हो जाता है। बशर्ते कि सभी कणों को एक साथ या लगभग एक साथ लोड किया जाए, एक ही आकार के कणों को एक साथ निस्तारण करना चाहिए।

हालाँकि, चूंकि एक बृहद् अणु  के आकार के विभिन्न उपाय हैं (उदाहरण के लिए, परिभ्रमण की त्रिज्या और हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या), एसईसी के सिद्धांत में एक मूलभूत समस्या एक उचित आणविक आकार के पैरामीटर का विकल्प है जिसके द्वारा अलग-अलग अणु प्रकार अलग किये जाते हैं। प्रायोगिक तौर पर, बेनोइट और सहकर्मियों ने कई अलग-अलग श्रृंखला वास्तुकला और रासायनिक रचनाओं के लिए रेफरेंस वॉल्यूम और गतिशील रूप से आधारित आणविक आकार, हाइड्रोडायनामिक मात्रा के बीच एक उत्कृष्ट सहसंबंध पाया। हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम के आधार पर मनाया गया सहसंबंध सार्वभौमिक एसईसी अंशांकन के आधार के रूप में स्वीकार किया गया।

फिर भी, एसईसी डेटा की व्याख्या में हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम, डायनेमिक गुणों पर आधारित आकार का उपयोग पूर्ण रूप से समझा नहीं गया है। ऐसा इसलिए है क्योंकि एसईसी सामान्यतः कम प्रवाह दर की स्थिति में चलाया जाता है जहां हाइड्रोडायनामिक कारक का पृथक्करण पर बहुत कम प्रभाव होना चाहिए। वास्तव में, सिद्धांत और कंप्यूटर सिमुलेशन दोनों एक थर्मोडायनामिक पृथक्करण सिद्धांत मानते हैं: पृथक्करण प्रक्रिया दो प्रावस्थाों के बीच विलेय बृहद् अणु ्स के संतुलन वितरण (विभाजन) द्वारा निर्धारित की जाती है: अंतरालीय स्थान पर स्थित एक पतला थोक विलयन प्रावस्था और छिद्रों के भीतर सीमित विलयन प्रावस्था। स्तंभ पैकिंग सामग्री की। इस सिद्धांत के आधार पर, यह दिखाया गया है कि छिद्रों में पॉलिमर के विभाजन के लिए प्रासंगिक आकार पैरामीटर औसत अवधि आयाम है (मतलब एक रेखा पर अधिकतम प्रक्षेपण)। हालांकि इस मुद्दे को पूर्ण रूप से हल नहीं किया गया है, यह संभावना है कि माध्य अवधि आयाम और हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम दृढ़ता से सहसंबद्ध हैं। प्रत्येक आकार अपवर्जन स्तंभ में आणविक भार की एक सीमा होती है जिसे अलग किया जा सकता है। अपवर्जन सीमा स्तंभ 'वर्किंग' रेंज के ऊपरी छोर पर आणविक भार को परिभाषित करती है और जहां स्थिर प्रावस्था में फंसने के लिए अणु बहुत बड़े होते हैं। सीमा के निचले सिरे को पारगम्यता सीमा द्वारा परिभाषित किया गया है, जो एक अणु के आणविक भार को परिभाषित करता है जो कि स्थिर प्रावस्था के सभी छिद्रों में प्रवेश करने के लिए काफी छोटा है। इस आणविक द्रव्यमान के नीचे के सभी अणु इतने छोटे होते हैं कि वे एक बैंड के रूप में एल्यूट करते हैं।

फ़िल्टर किए गए विलयन को अंत में एकत्र किया जाता है जिसे एल्यूएट के रूप में जाना जाता है। शून्य आयतन में माध्यम में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े कण सम्मिलित हैं, और विलायक आयतन को स्तंभ आयतन के रूप में जाना जाता है।

निम्नलिखित सामग्रियां हैं जो सामान्यतः आकार अपवर्जन वर्णलेखन में झरझरा जेल मोतियों के लिए उपयोग की जाती हैं

निस्पंदन को प्रभावित करने वाले कारक
वास्तविक जीवन की स्थितियों में, विलयन में कणों का एक निश्चित आकार नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप यह संभावना होती है कि एक कण जो इसके ठीक पास से गुजरने वाले छिद्र से बाधित होगा। इसके अलावा, स्थिर-प्रावस्था कण आदर्श रूप से परिभाषित नहीं होते हैं; दोनों कण और छिद्र आकार में भिन्न हो सकते हैं। इसलिए रेफरेंस कर्व्स सामान्य वितरण  से मिलते जुलते हैं। स्थिर प्रावस्था भी एक कण के साथ अवांछनीय तरीके से बातचीत कर सकता है और अवधारण समय को प्रभावित कर सकता है, हालांकि स्तंभ निर्माताओं द्वारा स्थिर प्रावस्थाों का उपयोग करने के लिए बहुत सावधानी बरती जाती है जो निष्क्रिय हैं और इस मुद्दे को कम करते हैं।

वर्णलेखन के अन्य रूपों के जैसे, स्तंभ की लंबाई बढ़ाने से रिज़ॉल्यूशन में वृद्धि होती है, और स्तंभ का व्यास बढ़ने से स्तंभ की क्षमता बढ़ जाती है। अधिकतम रिज़ॉल्यूशन के लिए उचित स्तंभ पैकिंग महत्वपूर्ण है: एक ओवर-पैक स्तंभ मोतियों में छिद्रों को ढहा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप रिज़ॉल्यूशन का नुकसान होता है। एक अंडर-पैक्ड स्तंभ छोटी प्रजातियों के लिए सुलभ स्थिर प्रावस्था के सापेक्ष सतह क्षेत्र को कम कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उन प्रजातियों को छिद्रों में फंसने में कम समय लगता है। बंधुता वर्णलेखन तकनीकों के विपरीत, स्तंभ के शीर्ष पर एक विलायक सिर तेजी से संकल्प को कम कर सकता है क्योंकि प्रतिदर्श लोड करने से पहले फैलता है, डाउनस्ट्रीम रेफरेंस को चौड़ा करता है।

विश्लेषण
सरल मैनुअल स्तंभ में, एल्यूएंट को स्थिर मात्रा में एकत्र किया जाता है, जिसे भिन्न के रूप में जाना जाता है। जितने अधिक समान कण आकार में होते हैं उतनी ही अधिक संभावना होती है कि वे एक ही अंश में होते हैं और अलग से नहीं पाए जाते हैं। अधिक उन्नत स्तंभ निक्षालन की लगातार निगरानी करके इस समस्या को दूर करते हैं। चित्र:Chrom SephG-50.tif|thumb|दाएं|300 px|एक पौधे के प्रतिदर्श का आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राम (एसईसी) एकत्रित अंशों की अक्सर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जांच की जाती है ताकि कणों की एकाग्रता को निर्धारित किया जा सके। सामान्य स्पेक्ट्रोस्कोपी पहचान तकनीक अपवर्तक सूचकांक (आरआई) और पराबैंगनी (यूवी) हैं। स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से समान प्रजातियों (जैसे कि जैविक शुद्धिकरण के दौरान) को हटाते समय, प्रत्येक अंश की सामग्री की पहचान करने के लिए अन्य तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है। आरआई, कम कोण लेजर प्रकाश बिखरने, मल्टी-एंगल लेजर लाइट स्कैटरिंग MALS, यूवी, और/या चिपचिपापन मापन के साथ निरंतर प्रवाह का विश्लेषण करना भी संभव है।

रेफरेंस वॉल्यूम (Ve) आणविक हाइड्रोडायनामिक वॉल्यूम के लघुगणक के साथ मोटे तौर पर रैखिक घटता है। स्तंभों को अक्सर 4-5 मानक प्रतिदर्शों (जैसे, ज्ञात आणविक भार के मुड़े हुए प्रोटीन) का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जाता है, और एक प्रतिदर्श जिसमें थायरोग्लोबुलिन जैसे बहुत बड़े अणु होते हैं, जो शून्य मात्रा निर्धारित करते हैं। (ब्लू डेक्सट्रान की सिफारिश Vo निर्धारण के लिए नहीं की जाती है क्योंकि यह विषम है और परिवर्तनशील परिणाम दे सकता है) मानकों के रेफरेंस वॉल्यूम को थायरोग्लोबुलिन (Ve/Vo) के एल्यूशन वॉल्यूम से विभाजित किया जाता है और मानकों के आणविक भार के लॉग के खिलाफ प्लॉट किया जाता है।. एसईसी के शून्य आयतन के अंश में मौजूद मेटालोप्रोटीन को QPNC-PAGE द्वारा अलग किया जाता है।

जैव रासायनिक अनुप्रयोग
सामान्य तौर पर, एसईसी को कम-रिज़ॉल्यूशन वर्णलेखन माना जाता है क्योंकि यह समान प्रजातियों को बहुत ठीक रूप से नहीं पहचानता है, और इसलिए इसे अक्सर शुद्धिकरण के अंतिम प्रावस्था के लिए आरक्षित किया जाता है। तकनीक शुद्ध प्रोटीन की चतुर्धातुक संरचना का निर्धारण कर सकती है, जिसमें धीमी विनिमय समय होता है, क्योंकि इसे मूल विलयन स्थितियों के तहत किया जा सकता है, जो  बृहदाण्विक  इंटरैक्शन को संरक्षित करता है। एसईसी प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भी जांच कर सकता है, क्योंकि यह हाइड्रोडायनेमिक आयतन (आणविक भार नहीं) को मापता है, जिससे एक ही प्रोटीन के मुड़े हुए और खुले हुए संस्करणों को अलग-अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट प्रोटीन डोमेन का स्पष्ट हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या क्रमशः फ़ोल्ड और अनफोल्डेड रूपों के लिए 14 Å और 36 Å हो सकता है। एसईसी इन दो रूपों को अलग करने की अनुमति देता है, क्योंकि इसके छोटे आकार के कारण मुड़ा हुआ रूप बहुत बाद में समाप्त हो जाता है।

पॉलीमर संश्लेषण
एसईसी का उपयोग एक संश्लेषित बहुलक के आकार और पॉलीडिस्पेरिटी दोनों के माप के रूप में किया जा सकता है, अर्थात, बहुलक अणुओं के आकार के वितरण को खोजने की क्षमता। यदि ज्ञात आकार के मानक पहले चलाए जाते हैं, तो विश्लेषण के लिए चुने गए विलायक (अक्सर THF) में रुचि के बहुलक अणुओं के आकार को निर्धारित करने के लिए एक अंशांकन वक्र बनाया जा सकता है। वैकल्पिक तरीके से, लाइट स्कैटरिंग और/या विस्कोमेट्री जैसी तकनीकों का उपयोग एसईसी के साथ ऑनलाइन पूर्ण आणविक भार प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जो ज्ञात आणविक भार के मानकों के साथ अंशांकन पर भरोसा नहीं करते हैं। समान आणविक भार वाले दो पॉलिमर के आकार में अंतर के कारण, पूर्ण निर्धारण के तरीके सामान्य रूप से अधिक वांछनीय हैं। एक विशिष्ट एसईसी प्रणाली जल्दी से (लगभग आधे घंटे में) बहुलक रसायनज्ञों को प्रतिदर्श के आकार और बहुप्रकीर्णता के बारे में जानकारी दे सकती है। प्रारंभिक एसईसी का उपयोग विश्लेषणात्मक पैमाने पर बहुलक विभाजन के लिए किया जा सकता है।

कमियां
एसईसी में, द्रव्यमान को बहुलक अणुओं की हाइड्रोडायनामिक मात्रा के रूप में नहीं मापा जाता है, अर्थात विलयन में होने पर एक विशेष बहुलक अणु कितना स्थान लेता है। हालांकि, अनुमानित आणविक भार की गणना एसईसी डेटा से की जा सकती है क्योंकि आणविक भार और पॉलीस्टाइनिन के लिए हाइड्रोडायनामिक मात्रा के बीच वास्तविक संबंध पाया जा सकता है। इसके लिए, मानक के रूप में पॉलीस्टाइनिन का उपयोग किया जाता है। लेकिन हाइड्रोडायनामिक आयतन और आणविक भार के बीच संबंध सभी पॉलिमर के लिए समान नहीं है, इसलिए केवल एक अनुमानित माप प्राप्त किया जा सकता है। एक और दोष स्थिर प्रावस्था और विश्लेषण के बीच बातचीत की संभावना है। कोई भी अंतःक्रिया बाद के क्षालन समय की ओर ले जाती है और इस प्रकार एक छोटे विश्लेषण आकार की नकल करती है।

इस पद्धति का प्रदर्शन करते समय, एल्यूटिंग अणुओं के बैंड को चौड़ा किया जा सकता है। यह स्थिर प्रावस्था के अणुओं के माध्यम से गुजरने वाले गतिशील प्रावस्था अणुओं के प्रवाह के कारण होने वाली अशांति से हो सकता है। इसके अलावा, आणविक थर्मल प्रसार और कांच की दीवारों के अणुओं के बीच घर्षण और एलुएंट के अणु बैंड के विस्तार में योगदान करते हैं। चौड़ा करने के अलावा, बैंड एक दूसरे के साथ ओवरलैप भी करते हैं। नतीजतन, एलुएंट सामान्यतः काफी पतला हो जाता है। बैंड को चौड़ा करने की संभावना को रोकने के लिए कुछ सावधानियां बरती जा सकती हैं। उदाहरण के लिए, कोई प्रतिदर्श को स्तंभ के शीर्ष पर एक संकीर्ण, अत्यधिक केंद्रित बैंड में लागू कर सकता है। एलुएंट जितना अधिक केंद्रित होगा, प्रक्रिया उतनी ही अधिक कुशल होगी। हालांकि, एलुएंट को केंद्रित करना हमेशा संभव नहीं होता है, जिसे एक और नुकसान माना जा सकता है।

पूर्ण आकार अपवर्जन वर्णलेखन
निरपेक्ष आकार अपवर्जन वर्णलेखन (एएसईसी) एक ऐसी तकनीक है जो एक प्रकाश बिखरने वाले उपकरण को जोड़ती है, सामान्यतः बहु-कोण प्रकाश बिखरने (एमएएलएस) या स्थिर प्रकाश बिखरने (एसएलएस) का दूसरा रूप, लेकिन संभवतः एक गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) उपकरण, पूर्ण ग्राम अणुक द्रव्यमान और / या प्रोटीन और मैक्रोमोलेक्युलस के आकार माप के लिए एक आकार अपवर्जन वर्णलेखन प्रणाली के रूप में वे वर्णलेखन प्रणाली से बाहर निकलते हैं।

इस मामले में "निरपेक्ष" की परिभाषा यह है कि संदर्भ मानकों के एक सेट के साथ स्तंभ पर प्रतिधारण समय का अंशांकन ग्राम अणुक द्रव्यमान या हाइड्रोडायनामिक आकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है, जिसे अक्सर हाइड्रोडायनामिक व्यास (डी) के रूप में संदर्भित किया जाता है।H एनएम की इकाइयों में)। गैर-आदर्श स्तंभ इंटरैक्शन, जैसे इलेक्ट्रोस्टैटिक या हाइड्रोफोबिक सतह इंटरैक्शन जो मानकों के सापेक्ष अवधारण समय को संशोधित करते हैं, अंतिम परिणाम को प्रभावित नहीं करते हैं। इसी प्रकार, विश्लेषण और मानक के बीच अंतर का पूर्ण माप पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है; उदाहरण के लिए, MALS विश्लेषण के साथ, स्वाभाविक रूप से विकृत प्रोटीनों के  ग्राम अणुक द्रव्यमान को वास्तविक रूप से चित्रित किया जाता है, यद्यपि वे समान  ग्राम अणुक द्रव्यमान वाले गोलाकार प्रोटीनों की तुलना में बहुत पहले के समय में एल्यूट करते हैं, और यह ब्रंचयुक्त पॉलिमर के लिए भी सच है, जो रैखिक संदर्भ मानकों की तुलना में देर से होता है। समान  ग्राम अणुक द्रव्यमान के साथ।   Aएसईसी का एक अन्य लाभ यह है कि  ग्राम अणुक द्रव्यमान और/या आकार प्रत्येक बिंदु पर एक उत्तल शिखर पर निर्धारित होता है, और इसलिए शिखर के भीतर एकरूपता या बहुसंख्यता का संकेत देता है। उदाहरण के लिए, एक मोनोडिस्पर्स प्रोटीन के एसईसी-MALS विश्लेषण से पता चलेगा कि पूरे शिखर में समान मोलर द्रव्यमान वाले अणु होते हैं, जो मानक एसईसी विश्लेषण के साथ संभव नहीं है।

एसएलएस के साथ ग्राम अणुक द्रव्यमान का निर्धारण करने के लिए एकाग्रता माप के साथ प्रकाश प्रकीर्णन माप के संयोजन की आवश्यकता होती है। इसलिए एसईसी-MALS में सामान्यतः लाइट स्कैटरिंग डिटेक्टर और या तो एक अंतर रेफ्रेक्टोमीटर या UV/Vis एब्जॉर्बेंस डिटेक्टर सम्मिलित  होता है। इसके अलावा, MALS rms त्रिज्या R को निर्धारित करता हैg एक निश्चित आकार सीमा से ऊपर के अणु, सामान्यतः 10 एनएम। इसलिए एसईसी-MALS  ग्राम अणुक द्रव्यमान से R के संबंध के माध्यम से पॉलिमर की रचना का विश्लेषण कर सकते हैंg. छोटे अणुओं के लिए, या तो डीएलएस या, अधिक सामान्य रूप से, हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या निर्धारित करने के लिए एक अंतर विस्कोमीटर जोड़ा जाता है और उसी प्रकार आणविक संरचना का मूल्यांकन करता है।

एसईसी-डीएलएस में, मैक्रोमोलेक्युलस के आकार को मापा जाता है क्योंकि वे आकार अपवर्जन स्तंभ सेट से डीएलएस उपकरण के प्रवाह सेल में प्रवेश करते हैं। अणुओं या कणों के हाइड्रोडायनामिक आकार को मापा जाता है न कि उनके आणविक भार को। प्रोटीन के लिए हाइड्रोडायनामिक आकार से आणविक भार का अनुमान लगाने के लिए मार्क-हौविंक प्रकार की गणना का उपयोग किया जा सकता है।

एसईसी के साथ मिलकर DLS का एक प्रमुख लाभ बढ़ा हुआ DLS रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की क्षमता है। बैच डीएलएस त्वरित और सरल है और औसत आकार का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है, लेकिन डीएलएस का आधारभूत रिज़ॉल्यूशन व्यास में 3:1 का अनुपात है। एसईसी का उपयोग करते हुए, प्रोटीन और प्रोटीन ओलिगोमर्स को अलग किया जाता है, जिससे ओलिगोमेरिक रिज़ॉल्यूशन की अनुमति मिलती है। Aएसईसी का उपयोग करके एकत्रीकरण अध्ययन भी किया जा सकता है। हालांकि समग्र एकाग्रता की गणना प्रकाश प्रकीर्णन के साथ नहीं की जा सकती है (एक ऑनलाइन एकाग्रता डिटेक्टर जैसे कि ग्राम अणुक द्रव्यमान माप के लिए एसईसी-MALS में उपयोग किया जाता है, जो कुल एकाग्रता को भी निर्धारित करता है), समुच्चय का आकार मापा जा सकता है, केवल अधिकतम आकार द्वारा सीमित किया जा सकता है। एसईसी स्तंभ से।

डीएलएस पहचान के साथ एएसईसी की सीमाओं में प्रवाह-दर, एकाग्रता और वास्तविकता सम्मिलित है। क्योंकि एक सहसंबंध समारोह को ठीक से बनाने के लिए कहीं भी 3-7 सेकंड की आवश्यकता होती है, इसलिए शिखर पर सीमित संख्या में डेटा बिंदु एकत्र किए जा सकते हैं। एसएलएस पहचान के साथ एएसईसी प्रवाह दर से सीमित नहीं है और माप समय अनिवार्य रूप से तात्कालिक है, और एकाग्रता की सीमा डीएलएस के मुकाबले परिमाण के कई आदेश हैं। हालांकि, एसईसी-MALS के साथ  ग्राम अणुक द्रव्यमान विश्लेषण के लिए वास्तविक एकाग्रता माप की आवश्यकता होती है। एसईसी द्वारा अलगाव के बाद अधिक व्यापक पूर्ण विश्लेषण के लिए एमएएलएस और डीएलएस डिटेक्टरों को अक्सर एक ही उपकरण में जोड़ा जाता है।

यह भी देखें

 * पेगिलेशन
 * जेल निस्पंदन वर्णलेखन
 * प्रोटीन शुद्धि

बाहरी संबंध
Gel-Permeations-Chromatografie クロマトグラフィー