सीआरआईएसपीआर व्यतिकरण

सीआरआईएसपीआर हस्तक्षेप (सीआरआईएसपीआरआई) आनुवंशिक व्याकुलता तकनीक है जो की प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट दमन की अनुमति देती है। और इसे सर्वप्रथम स्टेनली क्यूई और वेंडेल लिम, एडम आर्किन, जोनाथन वीसमैन और जेनिफ़र डौडना की प्रयोगशालाओं में उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था। अतः जीन अभिव्यक्ति का अनुक्रम-विशिष्ट सक्रियण सीआरआईएसपीआर सक्रियण (सीआरआईएसपीआरए) को संदर्भित करता है।

जीवाणु आनुवंशिक प्रतिरक्षा प्रणाली पर आधारित - सीआरआईएसपीआर (क्लस्टर नियमित रूप से अंतराल वाले छोटे पैलिंड्रोमिक दोहराव) मार्ग, तकनीक आरएनए हस्तक्षेप के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करती है। हालाँकि, सीआरआईएसपीआरआई और RNAi के बीच अंतर यह है कि सीआरआईएसपीआरआई  मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जबकि RNAi mRNA स्तर पर जीन को नियंत्रित करता है।

पृष्ठभूमि
कई जीवाणु और अधिकांश आर्किया में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली होती है जिसमें सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) और सीआरआईएसपीआर-संबद्ध (कैस) जीन शामिल होते हैं।

CRISPR हस्तक्षेप (सीआरआईएसपीआरआई ) तकनीक की रिपोर्ट सर्वप्रथम 2013 की शुरुआत में सैन फ्रांसिस्को में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के लेई एस. क्यूई और शोधकर्ताओं द्वारा की गई थी। प्रौद्योगिकी उत्प्रेरक रूप से मृत Cas9 (आमतौर पर डीसीएएस9 के रूप में चिह्नित) प्रोटीन का उपयोग करती है जिसमें आरएनए-निर्देशित तरीके से जीन को विनियमित करने के लिए एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि का अभाव होता है। लक्ष्यीकरण विशिष्टता जीनोमिक लोकस के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) की पूरक आधार-पेयरिंग द्वारा निर्धारित की जाती है। एसजीआरएनए काइमेरिक नॉनकोडिंग आरएनए है जिसे तीन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम, 42 एनटी डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन और 40 एनटी टर्मिनेटर (बैक्टीरिया,  ख़मीर, फल मक्खियाँ, जेब्राफिश, चूहे ).

सिंथेटिक एसजीआरएनए को डिजाइन करते समय, केवल 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम को संशोधित किया जाता है। माध्यमिक चर पर भी विचार किया जाना चाहिए: ऑफ-टार्गेट प्रभाव (जिसके लिए बेस-पेयरिंग अनुक्रम का सरल ब्लास्ट रन आवश्यक है), डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन संरचना का रखरखाव, और यह सुनिश्चित करना कि संशोधित sgRNA में कोई प्रतिबंध साइट मौजूद नहीं है, क्योंकि इससे डाउनस्ट्रीम क्लोनिंग चरणों में समस्या उत्पन्न हो सकती है। एसजीआरएनए डिज़ाइन की सरलता के कारण, यह तकनीक जीनोम-वाइड स्केलिंग के लिए उत्तरदायी है।

सीआरआईएसपीआरआई उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय Cas9 की पीढ़ी पर निर्भर करता है। यह जीन एन्कोडिंग Cas9 के दो उत्प्रेरक अवशेषों (D10A और H840A) में बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करके पूरा किया गया है। ऐसा करने पर, डीसीएएस9 dsDNA को तोड़ने में असमर्थ है लेकिन डीएनए को लक्षित करने की क्षमता बरकरार रखता है। साथ में, sgRNA और डीसीएएस9 जीन-विशिष्ट विनियमन के लिए न्यूनतम प्रणाली का निर्माण करते हैं।

दमन
सीआरआईएसपीआरआई ट्रांसक्रिप्शनल दीक्षा या बढ़ाव को अवरुद्ध करके प्रतिलेखन (आनुवांशिकी) को स्थिर रूप से दबा सकता है। यह प्रवर्तक (आनुवांशिकी) या एक्सोनिक अनुक्रमों के पूरक एसजीआरएनए को डिजाइन करके पूरा किया जाता है। कोडिंग अनुक्रम के भीतर लक्ष्य के साथ ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर स्ट्रैंड-विशिष्ट है।सीआरआईएसपीआर इफ़ेक्टर की प्रकृति के आधार पर, टेम्पलेट या गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड मजबूत दमन की ओर ले जाता है।

डीसीएएस9 (टाइप-2 CRISPR प्रणाली पर आधारित) के लिए, जब गाइड RNA गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है तो दमन अधिक मजबूत होता है। यह सुझाव दिया गया है कि यह हेलिकेज़ की गतिविधि के कारण है, जो आरएनए पोलीमरेज़ II से पहले आरएनए: डीएनए हेटेरोडुप्लेक्स को खोल देता है जब एसजीआरएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है। ट्रांसक्रिप्शन बढ़ाव ब्लॉक के विपरीत, ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट को लक्षित करते समय साइलेंसिंग लक्षित डीएनए स्ट्रैंड से स्वतंत्र होती है। प्रोकैरियोट्स में, यह स्थैतिक निषेध लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को लगभग 99.9% तक दबा सकता है; आर्किया में, 90% से अधिक दमन हासिल किया गया था; मानव कोशिकाओं में 90% तक दमन देखा गया। बैक्टीरिया में, लक्ष्य को पर्याप्त उच्च स्तर के डीसीएएस9 कॉम्प्लेक्स से संतृप्त करना संभव है। इस मामले में, दमन शक्ति केवल इस संभावना पर निर्भर करती है कि आरएनए पोलीमरेज़ के साथ टकराव पर डीसीएएस9 बाहर निकल जाता है, जो गाइड अनुक्रम द्वारा निर्धारित होता है। उच्च तापमान उच्च निष्कासन संभावना से भी जुड़ा होता है, इस प्रकार कमजोर दमन होता है। यूकेरियोट्स में, सीआरआईएसपीआरआई प्रभावक डोमेन के माध्यम से प्रतिलेखन को भी दबा सकता है। दमनकारी डोमेन को डीसीएएस9 में फ़्यूज़ करने से हेटरोक्रोमैटिनाइज़ेशन को प्रेरित करके प्रतिलेखन को और अधिक दबाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानव कोशिकाओं में लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को 99% तक दबाने के लिए अच्छी तरह से अध्ययन किए गए क्रुप्पेल एसोसिएटेड बॉक्स (KRAB) डोमेन को डीसीएएस9 से जोड़ा जा सकता है।

दक्षता में सुधार
जबकि उत्प्रेरक रूप से सक्रिय Cas9 न्यूक्लियस द्वारा जीनोम-संपादन अपरिवर्तनीय ऑफ-टारगेट जीनोमिक परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, सीआरआईएसपीआरआई दो अलग-अलग sgRNA अनुक्रमों के लिए न्यूनतम ऑफ-टारगेट प्रतिवर्ती प्रभावों के साथ अत्यधिक विशिष्ट है। बहरहाल, ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन की दक्षता में सुधार के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल की पहचान और एसजीआरएनए की प्राथमिकताओं पर विचार करने से दक्षता में सुधार होता है, जैसा कि लक्ष्य स्थल पर सुलभ क्रोमेटिन की उपस्थिति से होता है।

अन्य विधियाँ
उल्लिखित अन्य #फायदों और सीमाओं के साथ, प्रतिलेखन प्रारंभ से दूरी और स्थानीय क्रोमैटिन स्थिति जैसे कारक सक्रियण/दमन दक्षता निर्धारित करने में महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकते हैं। डीसीएएस9 और sgRNA अभिव्यक्ति, स्थिरता, परमाणु स्थानीयकरण और इंटरैक्शन का अनुकूलन संभवतः स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआरआई दक्षता में और सुधार की अनुमति देगा।

जीन नॉकडाउन
यूकेरियोट्स में जीनोम (रिपोर्टर और अंतर्जात जीन दोनों) का महत्वपूर्ण हिस्सा आरएनएआई और टेल प्रोटीन जैसी मौजूदा तकनीकों की तुलनीय दक्षता के साथ, डीसीएएस9 और sgRNAs को व्यक्त करने के लिए लेंटिवायरल निर्माणों का उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है। अग्रानुक्रम में या अपनी स्वयं की प्रणाली के रूप में, सीआरआईएसपीआरआई का उपयोग RNAi के समान RNA हस्तक्षेप#अनुप्रयोग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

बैक्टीरिया के लिए, सीआरआईएसपीआरआई द्वारा जीन नॉकडाउन को पूरी तरह से कार्यान्वित किया गया है और ग्राम-नेगेटिव ई. कोलाई दोनों के लिए (ऑफ-टार्गेट विश्लेषण, लीकी दमन) की विशेषता बताई गई है। और ग्राम-पॉजिटिव बी. सबटिलिस। न केवल बैक्टीरिया में बल्कि आर्किया (उदाहरण के लिए, एम. एसिटिवोरन्स) में भी सीआरआईएसपीआरआई -Cas9 का उपयोग नाइट्रोजन स्थिरीकरण से संबंधित कई जीन/ऑपेरॉन को नष्ट करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था।

फ़ाइल:CRISPRflowchart.pdf|अंगूठा

एलिलिक श्रृंखला
लक्ष्य लोकी में एसजीआरएनए बेस-पेयरिंग की दक्षता को संशोधित करके विभेदक जीन अभिव्यक्ति प्राप्त की जा सकती है। सिद्धांत रूप में, इस दक्षता को संशोधित करके किसी भी जीन के लिए एलीलिक श्रृंखला बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है, संक्षेप में हाइपो- और हाइपरमोर्फ का संग्रह तैयार किया जा सकता है। इन शक्तिशाली संग्रहों का उपयोग किसी भी आनुवंशिक जांच की जांच के लिए किया जा सकता है। मुलर के मॉर्फ के लिए, यह जीन नॉकआउट की द्विआधारी प्रकृति और नॉकडाउन की अप्रत्याशितता के विपरीत जीन फ़ंक्शन की वृद्धिशील कमी की अनुमति देता है। मुलर के मॉर्फ के लिए, यह चर शक्ति वाले प्रमोटरों के तहत रुचि के जीन की क्लोनिंग की पारंपरिक विधि के विपरीत है।

जीनोम लोकी इमेजिंग
हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन को डीसीएएस9 में मिलाने से जीवित मानव कोशिकाओं में जीनोमिक लोकी की इमेजिंग की अनुमति मिलती है। स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति की तुलना में, विधि विशिष्ट रूप से गुणसूत्र लोकी की गतिशील ट्रैकिंग की अनुमति देती है। इसका उपयोग हेला कोशिकाओं सहित प्रयोगशाला सेल लाइनों में क्रोमैटिन वास्तुकला और परमाणु संगठन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है।

स्टेम कोशिकाएँ
सीआरआईएसपीआरए द्वारा रिप्रोग्रामिंग के सक्रियण का उपयोग मानव और माउस कोशिकाओं प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल को प्रेरित करने के लिए किया गया है जो आईपीएस प्रौद्योगिकी के लिए वैकल्पिक विधि प्रदान करता है। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर सक्रियण स्क्रीन का उपयोग उन प्रोटीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो प्रेरित प्लुरिपोटेंसी को बढ़ावा देते हैं या, इसके विपरीत, भेदभाव को बढ़ावा देते हैं एक विशिष्ट कोशिका वंश के लिए।

जेनेटिक स्क्रीनिंग
एकल sgRNA के साथ डीसीएएस9-SunTag का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड करने की क्षमता बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन, जैसे कि पर्टर्ब-सीक, के द्वार भी खोलती है, जिससे जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि या कमी के परिणामस्वरूप होने वाले फेनोटाइप को उजागर किया जा सके, जो समझने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होगा। कैंसर में जीन विनियमन का प्रभाव. इसके अलावा, सीआरआईएसपीआरआई सिस्टम को क्षैतिज जीन स्थानांतरण तंत्र जैसे जीवाणु संयुग्मन और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन के विशिष्ट दमन के माध्यम से हस्तांतरणीय दिखाया गया है। सीआरआईएसपीआरआई  आनुवंशिक जांच और संभावित जीवाणु जनसंख्या नियंत्रण के लिए उपकरण के रूप में काम कर सकता है।

फायदे

 * 1) सीआरआईएसपीआरआई हित के लक्ष्य जीन को 99.9% दमन तक शांत कर सकता है। दमन की ताकत को गाइड आरएनए और लक्ष्य के बीच पूरकता की मात्रा को बदलकर भी समायोजित किया जा सकता है। प्रेरक प्रवर्तकों के विपरीत, सीआरआईएसपीआरआई  द्वारा आंशिक दमन लक्ष्य की अभिव्यक्ति में ट्रांसक्रिप्शनल शोर नहीं जोड़ता है। चूंकि दमन का स्तर डीएनए अनुक्रम में एन्कोड किया गया है, इसलिए विभिन्न अभिव्यक्ति स्तरों को प्रतिस्पर्धा में विकसित किया जा सकता है और अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है।
 * 2) चूंकि सीआरआईएसपीआरआई एसजीआरएनए-डीएनए के वॉटसन-क्रिक बेस-पेयरिंग और एनजीजी पीएएम मोटिफ पर आधारित है, इसलिए जीनोम के भीतर लक्षित साइटों का चयन सीधा और लचीला है। सावधानीपूर्वक परिभाषित प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। #एकाधिक sgRNAs का उपयोग न केवल साथ कई अलग-अलग जीनों को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है (मल्टीप्लेक्स सीआरआईएसपीआरआई ), बल्कि ही जीन लक्ष्य को विनियमित करने की दक्षता को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। कई एसजीआरएनए को साथ व्यक्त करने की लोकप्रिय रणनीति एसजीआरएनए को कई प्रमोटरों या प्रसंस्करण तत्वों के साथ ही निर्माण में व्यवस्थित करना है। उदाहरण के लिए, एक्स्ट्रा-लॉन्ग एसजीआरएनए एरेज़ (ईएलएसए) जीन संश्लेषण प्रदाता से 12-एसजीआरएनए एरेज़ के सीधे संश्लेषण की अनुमति देने के लिए गैर-दोहराव वाले भागों का उपयोग करते हैं, इसे सीधे ई. कोली जीनोम में समरूप पुनर्संयोजन के बिना एकीकृत किया जा सकता है, और साथ कई जीनों को लक्षित कर सकते हैं। जटिल फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए।
 * 3) हालाँकि दोनों प्रणालियाँ पूरक हो सकती हैं, सीआरआईएसपीआरआई RNAi की तुलना में लाभ प्रदान करता है। बहिर्जात प्रणाली के रूप में, सीआरआईएसपीआरआई  माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति या फ़ंक्शन जैसी अंतर्जात मशीनरी के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं करता है। इसके अलावा, क्योंकि सीआरआईएसपीआरआई  डीएनए स्तर पर कार्य करता है, कोई गैर-कोडिंग आरएनए, माइक्रोआरएनए, एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट, परमाणु-स्थानीयकृत आरएनए और पोलीमरेज़ III ट्रांसक्रिप्ट जैसे ट्रांसक्रिप्ट को लक्षित कर सकता है। अंत में, सीआरआईएसपीआरआई  के पास बहुत बड़ा लक्षित अनुक्रम स्थान है; प्रमोटरों और, सिद्धांत रूप में, इंट्रोन्स को भी लक्षित किया जा सकता है। #ई. कोली में, जीन नॉकडाउन स्ट्रेन का निर्माण बेहद तेज़ होता है और इसके लिए केवल एक-चरणीय ओलिगो पुनर्संयोजन की आवश्यकता होती है।

सीमाएँ
यूकेरियोट्स में #अनुक्रम-विशिष्ट विषाक्तता की सूचना मिली है, पीएएम-समीपस्थ क्षेत्र में कुछ अनुक्रमों के कारण बड़ा फिटनेस बोझ पैदा हो रहा है। यह घटना, जिसे ख़राब बीज प्रभाव कहा जाता है, अभी भी अस्पष्ट है लेकिन डीसीएएस9 के अभिव्यक्ति स्तर को अनुकूलित करके इसे कम किया जा सकता है।
 * 1) प्रोटोस्पेसर आसन्न रूपांकन (पीएएम) अनुक्रम की आवश्यकता संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या को सीमित करती है। Cas9 और इसके होमोलॉग विभिन्न PAM अनुक्रमों का उपयोग कर सकते हैं, और इसलिए संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या का विस्तार करने के लिए सैद्धांतिक रूप से इसका उपयोग किया जा सकता है। #लक्ष्य लोकी की अनुक्रम विशिष्टता केवल 14 एनटी लंबी (एसजीआरएनए की 12 एनटी और पीएएम की 2एनटी) है, जो मानव जीनोम में लगभग 11 बार पुनरावृत्ति कर सकती है। प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल से लक्ष्य स्थल की दूरी के साथ दमन का विपरीत संबंध है। जीनोम-व्यापी कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियां या लंबे PAM के साथ Cas9 होमोलॉग का चयन गैर-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को कम कर सकता है।
 * 2) अंतर्जात क्रोमैटिन अवस्थाएं और संशोधन डीसीएएस9-sgRNA कॉम्प्लेक्स के अनुक्रम-विशिष्ट बंधन को रोक सकते हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर जीन के बीच भिन्न होता है। बाइंडिंग और नियामक दक्षता के संबंध में स्थानीय डीएनए संरचना और क्रोमैटिन की भूमिका को समझने के लिए बहुत काम करने की आवश्यकता है।
 * 3) सीआरआईएसपीआरआई उन जीनों को प्रभावित कर सकता है जो लक्ष्य जीन के करीब हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब उन जीनों को लक्षित किया जाता है जो या तो अन्य जीनों (सेंस या एंटीसेंस ओवरलैपिंग) को ओवरलैप करते हैं या द्विदिश प्रमोटर द्वारा संचालित होते हैं।