न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरैमिडाइट

न्यूक्लीओसाइड फॉस्फोरामाइडाइट प्राकृतिक या सिंथेटिक न्यूक्लियोसाइड के डेरिवेटिव हैं। वे [[oligonucleotide संश्लेषण]] ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स,  न्यूक्लिक अम्ल  के अपेक्षाकृत कम टुकड़े और उनके न्यूक्लिक एसिड एनालॉग्स के लिए उपयोग किए जाते हैं। न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइडाइट्स को पहली बार 1981 में ब्यूकेज और कारुथर्स द्वारा पेश किया गया था। अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए, प्राकृतिक या सिंथेटिक न्यूक्लियोसाइड में मौजूद प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सी और एक्सोसाइक्लिक अमीनो समूह उचित रूप से संरक्षित हैं। जब तक एक न्यूक्लियोसाइड एनालॉग में कम से कम एक हाइड्रॉक्सी समूह होता है, तब तक उपयुक्त सुरक्षा रणनीति का उपयोग किसी को संबंधित फॉस्फोरामाइडाइट में परिवर्तित करने और बाद वाले को सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड में शामिल करने की अनुमति देता है। फॉस्फोरैमिडाइट रणनीति का उपयोग करके ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला के बीच में शामिल होने के लिए, न्यूक्लियोसाइड एनालॉग में दो हाइड्रॉक्सी समूह या कम अक्सर, एक हाइड्रॉक्सी समूह और एक अन्य न्यूक्लियोफिलिक समूह (एमिनो या मर्कैप्टो) होना चाहिए। उदाहरणों में न्यूक्लिक एसिड एनालॉग्स,  बंद न्यूक्लिक एसिड, मोर्फोलिनो, न्यूक्लियोसाइड 2'-स्थिति (ओएमई, संरक्षित एनएच) में संशोधित शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं।2, एफ), गैर-विहित आधारों वाले न्यूक्लियोसाइड्स (हाइपोक्सैन्थिन और ज़ैंथिन प्राकृतिक न्यूक्लियोसाइड्स  आइनोसीन  और जैन्थोसिन में निहित हैं, क्रमशः ट्राइसाइक्लिक बेस जैसे जी-क्लैंप, आदि) या एक फ्लोरोसेंट समूह या एक लिंकर आर्म के साथ व्युत्पन्न आधार।

तैयारी
न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरैमिडाइट्स की तैयारी के लिए तीन मुख्य विधियाँ हैं।
 * Nucl Amidite Synthesis1.pngसामान्य विधि में एक कमजोर एसिड की उत्प्रेरक क्रिया के तहत फॉस्फोरोडायमाइडाइट के साथ एक एकल मुक्त हाइड्रॉक्सी समूह वाले संरक्षित न्यूक्लियोसाइड का उपचार शामिल है। हालाँकि कुछ बिसामिडिट्स को ऊष्मीय रूप से अस्थिर यौगिकों के रूप में सूचित किया गया था, 2-सायनोइथाइल एन, एन, एन', एन'-टेट्राइसोप्रोपाइलफॉस्फोरोडायमाइडाइट, वाणिज्यिक न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइडाइट तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला एमिडाइट अपेक्षाकृत स्थिर है। इसे दो-चरण, एक-पॉट प्रक्रिया का उपयोग करके संश्लेषित किया जा सकता है और  खालीपन  आसवन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। एक उत्कृष्ट समीक्षा न्यूक्लियोसिडिक और गैर-न्यूक्लियोसिडिक फॉस्फोरामाइडाइट्स की तैयारी में बाद के अभिकर्मक के उपयोग को बहुत विस्तार से रेखांकित करती है।


 * Nucl Amidite Synthesis2.pngदूसरी विधि में, संरक्षित न्यूक्लियोसाइड को कार्बनिक आधार की उपस्थिति में फॉस्फोरोक्लोराइडाइट के साथ इलाज किया जाता है, आमतौर पर एन, एन-डायसोप्रोपाइलथाइलामाइन | एन-एथिल-एन, एन-डायसोप्रोपाइलमाइन (हनीग का आधार)।


 * Nucl Amidite Synthesis3.pngतीसरी विधि में, संरक्षित न्यूक्लियोसाइड को सबसे पहले क्लोरो एन, एन, एन', एन'-टेट्राइसोप्रोपाइल फॉस्फोरोडायमाइडाइट के साथ कार्बनिक आधार की उपस्थिति में इलाज किया जाता है, आमतौर पर एन-एथिल-एन, एन-डायसोप्रोपाइलमाइन (हुनिग का आधार) एक संरक्षित न्यूक्लियोसाइड डायमाइट बनाने के लिए। उत्तरार्द्ध को कमजोर एसिड की उपस्थिति में वांछित फॉस्फेट सुरक्षा समूह से संबंधित अल्कोहल के साथ इलाज किया जाता है, उदाहरण के लिए, 2-साइनोएथेनॉल।

सिलिका जेल पर कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइडाइट्स को शुद्ध किया जाता है। फॉस्फोरैमिडाइट अंश की स्थिरता को सुनिश्चित करने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि कॉलम को 3 से 5% ट्राइथाइलमाइन युक्त एलुएंट के साथ संतुलित करें और अलगाव के पूरे पाठ्यक्रम में इस एकाग्रता को एलुएंट में बनाए रखें। फॉस्फोरैमिडाइट की शुद्धता का आकलन किसके द्वारा किया जा सकता है? 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी। जैसा कि न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरैमिडाइट में पी (III) परमाणु चिरल है, यह यौगिक के दो डायस्टेरोमर्स के अनुरूप लगभग 149 पीपीएम पर दो चोटियों को प्रदर्शित करता है। संभावित रूप से मौजूद फास्फाइट ट्राइस्टर अशुद्धता 138-140 पीपीएम पर चरम प्रदर्शित करती है। एच-फॉस्फोनेट अशुद्धियां 8 और 10 पीपीएम पर चोटियों को प्रदर्शित करती हैं।

फॉस्फोरैमिडाइट मोइटी के रासायनिक गुण
न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइडाइट्स लंबे समय तक हाफ लाइफ के साथ अपेक्षाकृत स्थिर यौगिक होते हैं जब 4 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर हवा की अनुपस्थिति में निर्जल परिस्थितियों में पाउडर के रूप में संग्रहीत किया जाता है। एमिडाइट हल्के बुनियादी स्थितियों का सामना करते हैं। इसके विपरीत, हल्के अम्लों की उपस्थिति में भी, फॉस्फोरामाइडाइट लगभग तुरंत नष्ट हो जाते हैं। फॉस्फोरामाइडाइट्स तटस्थ परिस्थितियों में हाइड्रोलिसिस के लिए अपेक्षाकृत स्थिर हैं। उदाहरण के लिए, 2-साइनोइथाइल 5'-ओ-(4,4'-डाइमेथोक्सीट्रिटिल) थाइमिडीन -3'-ओ-(एन,एन-डायसोप्रोपाइलैमिनो) फॉस्फेट का आधा जीवन 25 डिग्री सेल्सियस पर 95% जलीय एसीटोनिट्रिल में 200 एच है. जब पानी को न्यूक्लियोफाइल के रूप में परोसा जाता है, तो उत्पाद एच-फॉस्फोनेट डायस्टर होता है जैसा कि ऊपर की योजना में दिखाया गया है। सॉल्वैंट्स और अभिकर्मकों में अवशिष्ट पानी की उपस्थिति के कारण, बाद वाले यौगिक का गठन फॉस्फोरैमिडाइट्स के प्रारंभिक उपयोग में सबसे आम जटिलता है, विशेष रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण में।
 * Nucl Amidite Nucleophiles.pngफॉस्फोरामिडाइट्स की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता फॉस्फोरैमाइडाइट युग्मन प्रतिक्रिया से गुजरने की उनकी क्षमता है, जो कि एक अम्लीय एज़ोल उत्प्रेरक, टेट्राज़ोल की उपस्थिति में न्यूक्लियोफिलिक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए है। 2-बेंज़िल थियो टेट्राज़ोल, 4,5-डाइसानो imidazole, या इसी तरह के कई यौगिक। प्रतिक्रिया बहुत तेजी से आगे बढ़ती है। यह बहुत ही विशेषता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण में न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइड्स को उपयोगी मध्यवर्ती बनाती है। त्रिविम रासायनिक रूप से, फॉस्फोरैमिडाइट युग्मन पी (III) चिरल केंद्र पर epimerisation (diastereomers का गठन) की ओर जाता है।


 * Nucl Amidite Oxidation.pngफॉस्फोरामाइड्स कमजोर ऑक्सीडेटिंग अभिकर्मकों के साथ आसानी से ऑक्सीकृत होते हैं, उदाहरण के लिए, कमजोर आधारों की उपस्थिति में या हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ जलीय आयोडीन के साथ संबंधित फॉस्फोरामिडेट बनाने के लिए।

इसी तरह, फॉस्फोरामाइडाइट्स अन्य काल्कोजन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। जब सल्फर के घोल के संपर्क में लाया जाता है या कई यौगिकों को सामूहिक रूप से ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण #सल्फराइजेशन एजेंट के रूप में संदर्भित किया जाता है, फॉस्फोरामाइडाइट्स मात्रात्मक रूप से फॉस्फोरोथियोएमिडेट्स बनाते हैं। सेलेनियम के साथ प्रतिक्रिया  या सेलेनियम डेरिवेटिव फॉस्फोरोसेलेनोमाइडेट्स का उत्पादन करता है। इस प्रकार की सभी अभिक्रियाओं में फॉस्फोरस परमाणु का विन्यास बना रहता है।


 * Nucl Amidite Arbuzov.pngन्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइडाइट संबंधित फॉस्फोनामिडेट्स बनाने के लिए माइकलिस-अर्बुज़ोव प्रतिक्रिया से गुजरते हैं। एक उदाहरण एक्रिलोनिट्राइल की उपस्थिति में फॉस्फोनैमिडेट्स की तैयारी का वर्णन करता है। कथित तौर पर, कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया फॉस्फोरस केंद्र में विन्यास की अवधारण के साथ त्रिविम चयनात्मक होती है। इसके विपरीत, जब 55 °C पर किया जाता है, तो प्रतिक्रिया रेसमीकरण उत्पादों की ओर ले जाती है।

(आरओ)2पी एन आर1)2 + आर2-एन3 + एच2ऊओ (बी)2पी (= ओ) - एन (आर)।1)2 + आर2-छोटा2 + एन2;
 * इसी तरह फॉस्फीन और तृतीयक फॉस्फेट के लिए, फॉस्फोरामाइडाइट आसानी से स्टुडिंगर प्रतिक्रिया से गुजरते हैं।

सुरक्षा रणनीति
स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले न्यूक्लियोटाइड्स (न्यूक्लियोसाइड-3'- या 5'-फॉस्फेट) और उनके फॉस्फोडिएस्टर एनालॉग्स उच्च पैदावार में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की एक त्वरित सिंथेटिक तैयारी को वहन करने के लिए अपर्याप्त रूप से प्रतिक्रियाशील हैं। न्यूक्लियोसाइड्स (न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामाइडाइट्स) के 3'-O-(N,N-diisopropyl phosphoramidite) डेरिवेटिव का उपयोग करके इंटरन्यूक्लियोसिडिक लिंकेज के गठन की चयनात्मकता और दर में नाटकीय रूप से सुधार किया जाता है जो फॉस्फेट ट्राइस्टर पद्धति में बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में काम करता है। अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, न्यूक्लियोसाइड्स में मौजूद अन्य सभी कार्यात्मक समूहों को सुरक्षात्मक समूहों को जोड़कर अप्राप्य (संरक्षित) प्रदान किया जाना चाहिए। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला असेंबली के पूरा होने पर, सभी सुरक्षा समूहों को वांछित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स प्राप्त करने के लिए हटा दिया जाता है। नीचे, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले सुरक्षा समूह  और सबसे आम न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरैमिडाइट बिल्डिंग ब्लॉक्स की संक्षिप्त समीक्षा की गई है:


 * 5'-हाइड्रॉक्सिल समूह एक एसिड-लेबाइल प्रोटेक्टिंग ग्रुप #DMT (4,4'-डाइमिथोक्सीट्रिटिल) समूह द्वारा संरक्षित है।
 * थाइमिन और यूरैसिल, क्रमशः थाइमिडीन और यूरिडीन के न्यूक्लिक बेस, में एक्सोसायक्लिक अमीनो समूह नहीं होते हैं और इसलिए उन्हें किसी सुरक्षा की आवश्यकता नहीं होती है। इसके विपरीत, न्यूक्लिक बेस एडीनाइन, साइटोसिन और गुआनिन एक्सोसायक्लिक अमीनो समूहों को सहन करते हैं, जो युग्मन प्रतिक्रिया की शर्तों के तहत सक्रिय फॉस्फोरामाइडाइट्स के साथ प्रतिक्रियाशील होते हैं। हालांकि, सिंथेटिक चक्र में अतिरिक्त चरणों की कीमत पर, असुरक्षित अमीनो समूहों के साथ फॉस्फोरामाइडाइट्स का उपयोग करके ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला असेंबली की जा सकती है, अक्सर इन्हें ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला असेंबली की पूरी लंबाई में स्थायी रूप से संरक्षित रखा जाता है। एक्सोसायक्लिक अमीनो समूहों की सुरक्षा 5'-हाइड्रॉक्सी समूह की ओर्थोगोनल होनी चाहिए क्योंकि बाद वाले को प्रत्येक सिंथेटिक चक्र के अंत में हटा दिया जाता है। लागू करने के लिए सबसे सरल और इसलिए सबसे व्यापक रूप से स्वीकृत वह रणनीति है जहां एक्सोसाइक्लिक अमीनो समूह एक बेस-लेबाइल सुरक्षा धारण करते हैं। सबसे अधिक बार, दो सुरक्षा योजनाओं का उपयोग किया जाता है।
 * पहले में, मानक और अधिक मजबूत योजना (चित्र), ए, डीए, सी, डीसी, जी, और डीजी के लिए सुरक्षा समूह#Bz (बेंज़ॉयल) सुरक्षा का उपयोग किया जाता है, जो isobutyryl समूह से सुरक्षित है। हाल ही में, चित्र में दिखाए गए अनुसार समूह # एसी (एसिटाइल) समूह की रक्षा करना अक्सर सी और डीसी की रक्षा के लिए प्रयोग किया जाता है।
 * दूसरे में, हल्की सुरक्षा योजना, A और dA isobutyryl से सुरक्षित हैं या फेनोक्सीसेटाइल समूह (पीएसी)। सी और डीसी भालू एसिटाइल संरक्षण, और G और dG 4-आइसोप्रोपिलफेनोक्सीसेटाइल (i-Pr-PAC) से सुरक्षित हैं या डाइमिथाइलफोर्मिडिनो (डीएमएफ) समूह। मानक सुरक्षा समूहों की तुलना में हल्के सुरक्षा समूहों को अधिक आसानी से हटा दिया जाता है। हालांकि, समाधान में संग्रहीत होने पर इन समूहों को प्रभावित करने वाले फॉस्फोरामाइड कम स्थिर होते हैं।
 * फास्फाइट समूह एक बेस-लैबाइल प्रोटेक्टिंग ग्रुप #CNEt|2-सायनोइथाइल समूह द्वारा संरक्षित है। एक बार एक फॉस्फोरैमिडाइट को ठोस समर्थन-बाध्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ जोड़ा गया है और फॉस्फेट मोएट्स को पी (वी) प्रजातियों में परिवर्तित कर दिया गया है, आगे युग्मन प्रतिक्रियाओं के सफल आयोजन के लिए फॉस्फेट संरक्षण की उपस्थिति अनिवार्य नहीं है।

* आरएनए संश्लेषण में, 2'-हाइड्रॉक्सी समूह को प्रोटेक्टिंग ग्रुप #TBDMS (t-butyldimethylsilyl) समूह से सुरक्षित किया जाता है।   या प्रोटेक्टिंग ग्रुप#TOM (ट्राई-आइसो-प्रोपिलसिलीलॉक्सिमिथाइल) ग्रुप के साथ,  दोनों फ्लोराइड आयन के साथ उपचार द्वारा हटाने योग्य हैं।
 * फास्फाइट भाग में डायसोप्रोपाइलैमिनो (iPr2एन) समूह अम्लीय परिस्थितियों में प्रतिक्रियाशील। सक्रियण पर, डायसोप्रोपाइलैमिनो समूह छोड़ देता है, जिसे समर्थन-बद्ध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के 5'-हाइड्रॉक्सी समूह द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।

यह भी देखें

 * डीएनए संश्लेषण
 * न्यूक्लिक एसिड एनालॉग्स
 * ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण

अग्रिम पठन

 * Comprehensive Natural Products Chemistry, Volume 7: DNA and Aspects of Molecular Biology. Kool, Eric T.; Editor. Neth. (1999), 733 pp. Publisher: (Elsevier, Amsterdam, Neth.)
 * Beaucage, S L. "Oligodeoxyribonucleotides synthesis. Phosphoramidite approach. Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ, United States) (1993), 20 (Protocols for Oligonucleotides and Analogs), 33–61.
 * Brown T., Brown D. J. S. 1991. In Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, ed. F Eckstein, pp. 1 – 24. Oxford: IRL
 * Beaucage, S L. "Oligodeoxyribonucleotides synthesis. Phosphoramidite approach. Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ, United States) (1993), 20 (Protocols for Oligonucleotides and Analogs), 33–61.
 * Brown T., Brown D. J. S. 1991. In Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, ed. F Eckstein, pp. 1 – 24. Oxford: IRL
 * Brown T., Brown D. J. S. 1991. In Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, ed. F Eckstein, pp. 1 – 24. Oxford: IRL
 * Brown T., Brown D. J. S. 1991. In Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, ed. F Eckstein, pp. 1 – 24. Oxford: IRL

Amidofosforyny