आकार अपवर्जन वर्णलेखन

आकार अपवर्जन वर्णलेखन (एसईसी), जिसे आणविक छलनी वर्णलेखन के रूप में भी जाना जाता है, एक वर्णलेखन विधि है जिसमें विलयन (रसायन विज्ञान) में अणुओं को उनके आकार और कुछ स्थितियों में आणविक भार से अलग किया जाता है। यह सामान्यतः बड़े अणुओं या बृहदाण्विक सम्मिश्रण जैसे प्रोटीन और औद्योगिक बहुलक पर लागू होता है। सामान्यतः, जब एक जलीय घोल का उपयोग स्तंभ के माध्यम से प्रतिदर्श को ले जाने के लिए किया जाता है, तो तकनीक को जेल-निस्पंदन वर्णलेखन के रूप में जाना जाता है, बनाम नाम जेल निस्पंदन वर्णलेखन, जिसका उपयोग तब किया जाता है जब एक कार्बनिक विलायक को गतिशील प्रावस्था के रूप में उपयोग किया जाता है। वर्णलेखन स्तंभ महीन, छिद्रपूर्ण मणिको से भरा होता है जो सामान्यतः डेक्स्ट्रान, एगारोस या पॉलिएक्रिलैमाइड बहुलक से बना होता है। बृहद् अणु के आयामों का अनुमान लगाने के लिए इन मणिको के छिद्रों के आकार का उपयोग किया जाता है।एसईसी व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला बहुलक लक्षण वर्णन विधि है, क्योंकि इसकी बहुलक के लिए अच्छे ग्राम अणुक द्रव्यमान वितरण (मेगावाट) परिणाम प्रदान करने की क्षमता है।

अनुप्रयोग
आकार अपवर्जन वर्णलेखन का मुख्य अनुप्रयोग प्रोटीन और अन्य जल में घुलनशील बहुलक का विभाजन है, जबकि जेल पारगमन वर्णलेखन का उपयोग कार्बनिक-घुलनशील बहुलक के आणविक भार वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। किसी भी तकनीक को जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए, जहां एक विद्युत क्षेत्र का उपयोग अणुओं को उनके विद्युत आवेशों के आधार पर जेल के माध्यम से खींचने के लिए किया जाता है। किसी छिद्र के भीतर विलेय के रहने की मात्रा, छिद्र के आकार पर निर्भर करती है। बड़े विलेय की छोटी मात्रा तक पहुंच होगी और इसके विपरीत। इसलिए, बड़े विलेय की तुलना में छोटा विलेय लंबे समय तक छिद्र के भीतर रहेगा।

आकार अपवर्जन वर्णलेखन का अन्य उपयोग जल में प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ की स्थिरता और विशेषताओं की जांच करना है। इस पद्धति में, मार्गिट बी. मुलर, डैनियल श्मिट, और फ्रिट्ज़ एच. फ्रिमेल ने संसार के विभिन्न स्थानों से जल के स्रोतों का परीक्षण किया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ समय के साथ कितना स्थिर है। यद्यपि प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थों का अध्ययन करने के लिए आकार अपवर्जन वर्णलेखन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, इसकी सीमाएँ हैं। इन सीमाओं में से एक में यह सम्मिलित है कि कोई मानक आणविक भार चिह्नक नहीं है; यदि वास्तविक आणविक भार की आवश्यकता होती है, तो अन्य विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए।

लाभ
इस पद्धति के लाभों में छोटे अणुओं से बड़े अणुओं का अच्छा पृथक्करण सम्मिलित है, जिसमें न्यूनतम मात्रा होता है, और विभिन्न विलयनों को निस्पंदन प्रक्रिया में हस्तक्षेप किए बिना लागू किया जा सकता है, सभी कणों की जैविक गतिविधि को अलग करने के लिए संरक्षित करते हुए। तकनीक सामान्यतः दूसरों के साथ संयुक्त होती है जो कुछ यौगिकों के लिए अम्लता, मूलता, आवेश और बंधुता जैसी अन्य विशेषताओं द्वारा अणुओं को अलग करती है। आकार अपवर्जन वर्णलेखन के साथ, कम और ठीक रूप से परिभाषित पृथक्करण समय और संकीर्ण बैंड होते हैं, जिससे अच्छी संवेदनशीलता होती है। कोई प्रतिदर्श हानि भी नहीं है क्योंकि विलेय स्थिर प्रावस्था के साथ परस्पर क्रिया नहीं करते हैं।

इस प्रायोगिक विधि का अन्य लाभ यह है कि कुछ स्थितियों में, यौगिक के अनुमानित आणविक भार को निर्धारित करना संभव है। यौगिक (एलुएंट) का आकार और आकार यह निर्धारित करता है कि यौगिक जेल (स्थिर प्रावस्था) के साथ कैसे संपर्क करता है। अनुमानित आणविक भार निर्धारित करने के लिए, उनके संबंधित आणविक भार वाले यौगिकों के क्षालन मात्रा प्राप्त किए जाते हैं और फिर "Kav"बनाम" लॉग (मेगावाट)" का एक आलेख बनाया जाता है, जहां $$K_{av} = (V_e-V_o)/(V_t-V_o)$$और मेगावाट आणविक द्रव्यमान होता है। यह आलेख अंशांकन वक्र के रूप में कार्य करता है, जिसका उपयोग वांछित यौगिक के आणविक भार को अनुमानित करने के लिए किया जाता है। Ve घटक उस मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर मध्यवर्ती अणु क्षालन करते हैं जैसे अणु जिनकी स्तंभ के मनकों तक आंशिक पहुंच होती है। इसके अतिरिक्त, Vt मनकों के बीच के कुल मात्रा और मनकों के भीतर के मात्रा का योग होता है। Vo घटक उस मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर बड़े अणु क्षालन करते हैं, जो प्रारम्भ में क्षालन होता है। उदाहरण के लिए, मात्र एक सीमित संख्या में बैंड को समायोजित किया जा सकता है क्योंकि वर्णलेख का समय परिमाण छोटा है, और सामान्यतः, अच्छा संकल्प प्राप्त करने के लिए आणविक द्रव्यमान में 10% अंतर होना चाहिए।

आविष्कार
इस तकनीक का आविष्कार 1955 में ग्रांट हेनरी लेथ और कॉलिन आर रूथवेन द्वारा किया गया था, जो क्वीन चार्लोट्स चिकित्सालय, लंदन में काम कर रहे थे। इस आविष्कार के लिए उन्हें बाद में जॉन स्कॉट पुरस्कार मिला। जबकि लेथ और रूथवेन ने आव्यूह के रूप में स्टार्च जैल का उपयोग किया, जर्कर पोरथ और प्रति फ्लोडिन ने बाद में डेक्सट्रान जैल प्रस्तुत किया; आकार के विभाजन गुणों वाले अन्य जैल में ऐगारोज और पॉलिएक्रिलैमाइड सम्मिलित हैं। इन घटनाक्रमों की एक संक्षिप्त समीक्षा सामने आई है।

कृत्रिम उच्च बहुलक को अलग करने का भी प्रयास किया गया; यद्यपि, यह 1964 तक नहीं था, जब डॉव केमिकल कंपनी के जे.सी. मूर ने नियंत्रित छिद्र आकार के साथ संकर- श्रृंखलित पॉलीस्टीरीन पर आधारित जेल पारगमन वर्णलेखन (जीपीसी) स्तंभ की तैयारी पर अपना काम प्रकाशित किया था, कि इस क्षेत्र में अनुसंधान गतिविधियों में तीव्रता से वृद्धि प्रारम्भ हुई। यह लगभग तुरंत पहचाना गया कि उचित अंशांकन के साथ, जीपीसी कृत्रिम बहुलक के लिए ग्राम अणुक द्रव्यमान और ग्राम अणुक द्रव्यमान वितरण जानकारी प्रदान करने में सक्षम था। क्योंकि बाद की जानकारी अन्य विधियों से प्राप्त करना कठिन था, जीपीसी तीव्रता से व्यापक उपयोग में आया।

सिद्धांत और विधि
एसईसी मुख्य रूप से प्रोटीन या बहुलक जैसे बड़े अणुओं के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। एसईसी अधिशोषक (स्थिर प्रावस्था) के छिद्रों में छोटे अणुओं को विपाशन का काम करता है। यह प्रक्रिया सामान्यतः एक स्तंभ के भीतर की जाती है, जिसमें सामान्यतः एक खोखली ट्यूब होती है जो माइक्रोन-परिमाण बहुलक मणिको से भरी होती है जिसमें विभिन्न आकारों के छिद्र होते हैं। ये छिद्र मणिक के माध्यम से सतह या चैनलों पर अवसाद हो सकते हैं। जैसे ही विलयन स्तंभ के नीचे जाता है, कुछ कण छिद्रों में प्रवेश कर जाते हैं। बड़े कण इतने छिद्रों में प्रवेश नहीं कर सकते। कण जितने बड़े होंगे, क्षालन उतना ही तीव्र होगा। बड़े अणु मात्र छिद्रों से समीप से निकलते हैं क्योंकि वे अणु छिद्रों में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े होते हैं। इसलिए बड़े अणु छोटे अणुओं की तुलना में अधिक तीव्रता से स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित होते हैं, अर्थात अणु जितना छोटा होता है, अवधारण समय उतना ही अधिक होता है।

एसईसी के लिए आवश्यकता यह है कि विश्लेषण स्थिर प्रावस्थाओं की सतह के साथ अंतःक्रिया नहीं करता है, विश्लेषणों के बीच क्षालन समय में अंतर के साथ आदर्श रूप से विलेय मात्रा पर आधारित होता है, जो स्थिर प्रावस्थाओं के साथ रासायनिक या विद्युत् स्थैतिक अंतःक्रिया के अतिरिक्त विश्लेषिकी में प्रवेश कर सकता है। इस प्रकार, छोटा अणु जो स्थिर प्रावस्था छिद्र प्रणाली के प्रत्येक क्षेत्र में प्रवेश कर सकता है, पूरे छिद्र मात्रा और अंतरकणीय मात्रा के योग के बराबर कुल मात्रा में प्रवेश कर सकता है। यह छोटा अणु विलंब से निकलता है(अणु के सभी छिद्र- और अंतरकणीय मात्रा में प्रवेश करने के बाद - स्तंभ मात्रा का लगभग 80%)। दूसरे छोर पर, एक बहुत बड़ा अणु जो किसी भी छोटे छिद्रों में प्रवेश नहीं कर सकता है, मात्र अंतरकणीय मात्रा(स्तंभ मात्रा का ~ 35%) में प्रवेश कर सकता है और जब गतिशील प्रावस्था की यह मात्रा स्तंभ के माध्यम से पारित हो जाती है तो इससे पूर्व क्षालन हो जाता है। एसईसी का अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि विभिन्न आकारों के कण अलग-अलग दरों पर एक स्थिर प्रावस्था के माध्यम से क्षालन (निस्पंदन) करते हैं। इसके परिणामस्वरूप आकार के आधार पर कणों का विलयन अलग हो जाता है। परंतु सभी कणों को एक साथ या लगभग एक साथ भारित किया जाए, एक ही आकार के कणों को एक साथ निस्तारण करना चाहिए।

यद्यपि, चूंकि एक बृहद् अणु के आकार के विभिन्न उपाय हैं (उदाहरण के लिए, परिभ्रमण की त्रिज्या और द्रवगतिकीय त्रिज्या), एसईसी के सिद्धांत में मूलभूत समस्या एक उचित आणविक आकार के पैरामीटर का विकल्प है जिसके द्वारा अलग-अलग अणु प्रकार अलग किये जाते हैं। प्रयोग के साथ, बेनोइट और सहकर्मियों ने कई अलग-अलग श्रृंखला स्थापत्य और रासायनिक रचनाओं के लिए क्षालन मात्रा और गतिशील रूप से आधारित आणविक आकार, द्रवगतिकीय मात्रा के बीच एक उत्कृष्ट सहसंबंध पाया। द्रवगतिकीय मात्रा के आधार पर मनाया गया सहसंबंध सार्वभौमिक एसईसी अंशांकन के आधार के रूप में स्वीकार किया गया।

फिर भी, एसईसी आंकड़े की व्याख्या में द्रवगतिकीय मात्रा, डायनेमिक गुणों पर आधारित आकार का उपयोग पूर्ण रूप से समझा नहीं गया है। ऐसा इसलिए है क्योंकि एसईसी सामान्यतः कम प्रवाह दर की स्थिति में चलाया जाता है जहां द्रवगतिकीय कारक का पृथक्करण पर बहुत कम प्रभाव होना चाहिए। वस्तुतः, सिद्धांत और कंप्यूटर अनुरूपण दोनों एक तापगतिकीय पृथक्करण सिद्धांत मानते हैं: पृथक्करण प्रक्रिया दो प्रावस्थाओं के बीच विलेय बृहद् अणु के संतुलन वितरण (विभाजन) द्वारा निर्धारित की जाती है: स्तंभ संकुलन पदार्थ के छिद्रों के भीतर अंतरालीय स्थान और सीमित विलयन में स्थित एक मन्दित थोक विलयन प्रावस्था। इस सिद्धांत के आधार पर, यह दिखाया गया है कि छिद्रों में बहुलक के विभाजन के लिए प्रासंगिक आकार पैरामीटर औसत अवधि आयाम है (एक रेखा पर औसत अधिकतम प्रक्षेपण)। यद्यपि इस निर्गम को पूर्ण रूप से हल नहीं किया गया है, यह संभावना है कि माध्य अवधि आयाम और द्रवगतिकीय मात्रा दृढ़ता से सहसंबद्ध हैं। प्रत्येक आकार अपवर्जन स्तंभ में आणविक भार की एक सीमा होती है जिसे अलग किया जा सकता है। अपवर्जन सीमा स्तंभ कार्यात्मक श्रेणी के ऊपरी छोर पर आणविक भार को परिभाषित करती है और जहां स्थिर प्रावस्था में प्रपाशन के लिए अणु बहुत बड़े होते हैं। सीमा के निचले सिरे को पारगम्यता सीमा द्वारा परिभाषित किया गया है, जो एक अणु के आणविक भार को परिभाषित करता है जो कि स्थिर प्रावस्था के सभी छिद्रों में प्रवेश करने के लिए अत्यधिक छोटा है। इस आणविक द्रव्यमान के नीचे के सभी अणु इतने छोटे होते हैं कि वे एक बैंड के रूप में क्षालन करते हैं।

निस्पंदन किए गए विलयन को अंत में एकत्र किया जाता है जिसे निक्षालन के रूप में जाना जाता है। शून्य मात्रा में माध्यम में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े कण सम्मिलित हैं, और विलायक मात्रा को स्तंभ मात्रा के रूप में जाना जाता है।

निम्नलिखित सामग्रियां हैं जो सामान्यतः आकार अपवर्जन वर्णलेखन में छिद्रपूर्ण जेल मणिको के लिए उपयोग की जाती हैं

निस्पंदन को प्रभावित करने वाले कारक
वास्तविक जीवन की स्थितियों में, विलयन में कणों का निश्चित आकार नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप यह संभावना होती है कि एक कण जो इसके ठीक समीप से निकलने वाले छिद्र से बाधित होगा। इसके अतिरिक्त, स्थिर-प्रावस्था कण आदर्श रूप से परिभाषित नहीं होते हैं; दोनों कण और छिद्र आकार में भिन्न हो सकते हैं। इसलिए क्षालन वक्र सामान्य वितरण से सदृश हैं। स्थिर प्रावस्था भी एक कण के साथ अवांछनीय रूप से अंतःक्रिया कर सकता है और अवधारण समय को प्रभावित कर सकता है, यद्यपि स्तंभ निर्माताओं द्वारा स्थिर प्रावस्थाओं का उपयोग करने के लिए बहुत सावधानी बरती जाती है जो निष्क्रिय हैं और इस निर्गम को कम करते हैं।

वर्णलेखन के अन्य रूपों के जैसे, स्तंभ की लंबाई बढ़ाने से स्थिरता में वृद्धि होती है, और स्तंभ का व्यास बढ़ने से स्तंभ की क्षमता बढ़ जाती है। अधिकतम स्थिरता के लिए उचित स्तंभ संकुलन महत्वपूर्ण है: एक अति संकुलित स्तंभ मणिको में छिद्रों को निपात कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थिरता की हानि होता है। एक अधीन संकुलित स्तंभ छोटी प्रजातियों के लिए सुलभ स्थिर प्रावस्था के सापेक्ष सतह क्षेत्र को कम कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उन प्रजातियों को छिद्रों में प्रपाशन में कम समय लगता है। बंधुता वर्णलेखन तकनीकों के विपरीत, स्तंभ के शीर्ष पर एक विलायक शीर्ष तीव्रता से संकल्प को कम कर सकता है क्योंकि प्रतिदर्श भारित करने से पूर्व फैलता है, अनुप्रवाह क्षालन को चौड़ा करता है।

विश्लेषण
सरल नियमावली स्तंभ में, एल्यूएंट को स्थिर मात्रा में एकत्र किया जाता है, जिसे भिन्न के रूप में जाना जाता है। जितने अधिक समान कण आकार में होते हैं उतनी ही अधिक संभावना होती है कि वे एक ही अंश में होते हैं और अलग से नहीं पाए जाते हैं। अधिक उन्नत स्तंभ निक्षालन की निरंतर अनुवीक्षण करके इस समस्या को दूर करते हैं। एकत्रित अंशों की प्रायः स्पेक्ट्रमी द्वारा जांच की जाती है ताकि कणों की एकाग्रता को निर्धारित किया जा सके। सामान्य स्पेक्ट्रमी पहचान तकनीक अपवर्तक सूचकांक(आरआई) और पराबैंगनी(यूवी) हैं। स्पेक्ट्रमी रूप से समान प्रजातियों(जैसे कि जैविक शुद्धिकरण के समय) को हटाते समय, प्रत्येक अंश के पदार्थ की पहचान करने के लिए अन्य तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है। आरआई, कम कोण लेजर प्रकाश प्रकीर्णन, बहु-कोण लेजर प्रकाश प्रकीर्णन एमएएलएस, यूवी, और/या श्यानता मापन के साथ निरंतर प्रवाह का विश्लेषण करना भी संभव है।

क्षालन मात्रा(Ve) आणविक द्रवगतिकीय मात्रा के लघुगणक के साथ साधारणतया रैखिक घटता है। स्तंभों को प्रायः 4-5 मानक प्रतिदर्शों(जैसे, ज्ञात आणविक भार के मुड़े हुए प्रोटीन) का उपयोग करके अंशांकित किया जाता है, और एक प्रतिदर्श जिसमें थायरोग्लोबुलिन जैसे बहुत बड़े अणु होते हैं, जो शून्य मात्रा निर्धारित करते हैं।(ब्लू डेक्सट्रान की संस्तुति Vo निर्धारण के लिए नहीं की जाती है क्योंकि यह विषम है और परिवर्तनशील परिणाम दे सकता है) मानकों के क्षालन मात्रा को थायरोग्लोबुलिन(Ve/Vo) के क्षालन मात्रा से विभाजित किया जाता है और मानकों के आणविक भार के लॉग के विरुद्ध आलेख किया जाता है। एसईसी के शून्य मात्रा के अंश में स्थित मेटालोप्रोटीन को क्यूपीएनसी-पृष्ठ द्वारा अलग किया जाता है।

जैव रासायनिक अनुप्रयोग
सामान्यतः, एसईसी को कम-स्थिरता वर्णलेखन माना जाता है क्योंकि यह समान प्रजातियों को बहुत ठीक रूप से नहीं पहचानता है, और इसलिए इसे प्रायः शुद्धिकरण के अंतिम प्रावस्था के लिए आरक्षित किया जाता है। तकनीक शुद्ध प्रोटीन की चतुर्धातुक संरचना का निर्धारण कर सकती है, जिसमें धीमी विनिमय समय होता है, क्योंकि इसे मूल विलयन स्थितियों के अंतर्गत किया जा सकता है, जो बृहदाण्विक अंतःक्रिया को संरक्षित करता है। एसईसी प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भी जांच कर सकता है, क्योंकि यह द्रवगतिकीय मात्रा(आणविक भार नहीं) को मापता है, जिससे एक ही प्रोटीन के मुड़े हुए और खुले हुए संस्करणों को अलग-अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट प्रोटीन कार्यक्षेत्र का स्पष्ट द्रवगतिकीय त्रिज्या क्रमशः फ़ोल्ड और अनफोल्डेड रूपों के लिए 14 Å और 36 Å हो सकता है। एसईसी इन दो रूपों को अलग करने की अनुमति देता है, क्योंकि इसके छोटे आकार के कारण मुड़ा हुआ रूप बहुत बाद में समाप्त हो जाता है।

बहुलक संश्लेषण
एसईसी का उपयोग एक संश्लेषित बहुलक के आकार और बहुप्रकीर्णता दोनों के माप के रूप में किया जा सकता है, अर्थात, बहुलक अणुओं के आकार के वितरण को खोजने की क्षमता है। यदि ज्ञात आकार के मानक पूर्व चलाए जाते हैं, तो विश्लेषण के लिए चुने गए विलायक (प्रायः टीएचएफ) में रुचि के बहुलक अणुओं के आकार को निर्धारित करने के लिए एक अंशांकन वक्र बनाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रकाश प्रकीर्णन और/या श्यानतामिति जैसी तकनीकों का उपयोग एसईसी के साथ ऑनलाइन पूर्ण आणविक भार प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जो ज्ञात आणविक भार के मानकों के साथ अंशांकन पर विश्वास नहीं करते हैं। समान आणविक भार वाले दो बहुलक के आकार में अंतर के कारण, पूर्ण निर्धारणकी विधियां सामान्य रूप से अधिक वांछनीय हैं। एक विशिष्ट एसईसी प्रणाली शीघ्रता से (लगभग आधे घंटे में) बहुलक रसायनज्ञों को प्रतिदर्श के आकार और बहुप्रकीर्णता के विषय में जानकारी दे सकती है। प्रारंभिक एसईसी का उपयोग विश्लेषणात्मक पैमाने पर बहुलक विभाजन के लिए किया जा सकता है।

कमियां
एसईसी में, द्रव्यमान को बहुलक अणुओं की द्रवगतिकीय मात्रा के रूप में नहीं मापा जाता है, अर्थात विलयन में होने पर एक विशेष बहुलक अणु कितना स्थान लेता है। यद्यपि, अनुमानित आणविक भार की गणना एसईसी आंकड़े से की जा सकती है क्योंकि आणविक भार और पॉलीस्टाइनिन के लिए द्रवगतिकीय मात्रा के बीच वास्तविक संबंध पाया जा सकता है। इसके लिए, मानक के रूप में पॉलीस्टाइनिन का उपयोग किया जाता है। परन्तु द्रवगतिकीय मात्रा और आणविक भार के बीच संबंध सभी बहुलक के लिए समान नहीं है, इसलिए मात्र एक अनुमानित माप प्राप्त किया जा सकता है। एक और दोष स्थिर प्रावस्था और विश्लेषण के बीच अंतःक्रिया की संभावना है। कोई भी अंतःक्रिया बाद के क्षालन समय की ओर ले जाती है और इस प्रकार एक छोटे विश्लेषण आकार की अनुकरण करती है।

इस पद्धति का प्रदर्शन करते समय, इल्यूटिंग अणुओं के बैंड को चौड़ा किया जा सकता है। यह स्थिर प्रावस्था के अणुओं के माध्यम से गुजरने वाले गतिशील प्रावस्था अणुओं के प्रवाह के कारण होने वाली विक्षोम से हो सकता है। इसके अतिरिक्त, आणविक उष्मीय प्रसार और कांच की दीवारों के अणुओं के बीच घर्षण और एलुएंट के अणु बैंड के विस्तार में योगदान करते हैं। चौड़ा करने के अतिरिक्त, बैंड एक दूसरे के साथ अधिव्यापन भी करते हैं। फलस्वरूप, एलुएंट सामान्यतः अत्यधिक मन्दित हो जाता है। बैंड को चौड़ा करने की संभावना को रोकने के लिए कुछ सावधानियां बरती जा सकती हैं। उदाहरण के लिए, कोई प्रतिदर्श को स्तंभ के शीर्ष पर एक संकीर्ण, अत्यधिक केंद्रित बैंड में लागू कर सकता है। एलुएंट जितना अधिक केंद्रित होगा, प्रक्रिया उतनी ही अधिक कुशल होगी। यद्यपि, एलुएंट को केंद्रित करना सदैव संभव नहीं होता है, जिसे एक और हानि मानी जा सकती है।

पूर्ण आकार अपवर्जन वर्णलेखन
निरपेक्ष आकार अपवर्जन वर्णलेखन (एएसईसी) एक ऐसी तकनीक है जो प्रकाश प्रकीर्णन वाले उपकरण को जोड़ती है, सामान्यतः बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन (एमएएलएस) या स्थिर प्रकाश प्रकीर्णन(एसएलएस) का दूसरा रूप, परन्तु संभवतः एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) उपकरण, पूर्ण ग्राम अणुक द्रव्यमान और / या प्रोटीन और बृहद् अणु के आकार माप के लिए एक आकार अपवर्जन वर्णलेखन प्रणाली के रूप में वे वर्णलेखन प्रणाली से बाहर निकलते हैं।

इस स्थिति में "निरपेक्ष" की परिभाषा यह है कि संदर्भ मानकों के एक समूह के साथ स्तंभ पर प्रतिधारण समय का अंशांकन ग्राम अणुक द्रव्यमान या द्रवगतिकीय आकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है, जिसे प्रायः द्रवगतिकीय व्यास(एनएम की इकाइयों में DH) के रूप में संदर्भित किया जाता है। गैर-आदर्श स्तंभ अंतःक्रिया, जैसे विद्युत् स्थैतिक या जलविरागी सतह अंतःक्रिया जो मानकों के सापेक्ष अवधारण समय को संशोधित करते हैं, अंतिम परिणाम को प्रभावित नहीं करते हैं। इसी प्रकार, विश्लेषण और मानक के बीच अंतर का पूर्ण माप पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है; उदाहरण के लिए, एमएएलएस विश्लेषण के साथ, स्वाभाविक रूप से विकृत प्रोटीनों के ग्राम अणुक द्रव्यमान को वास्तविक रूप से चित्रित किया जाता है, यद्यपि वे समान ग्राम अणुक द्रव्यमान वाले गोलाकार प्रोटीनों की तुलना में बहुत पूर्व के समय में क्षालन करते हैं, और यह शाखायुक्त बहुलक के लिए भी सत्य है, जो समान ग्राम अणुक द्रव्यमान के साथ रैखिक संदर्भ मानकों की तुलना में विलंब से होता है।  एएसईसी का एक अन्य लाभ यह है कि ग्राम अणुक द्रव्यमान और/या आकार प्रत्येक बिंदु पर एक उत्तल शिखर पर निर्धारित होता है, और इसलिए शिखर के भीतर एकरूपता या बहुसंख्यता का संकेत देता है। उदाहरण के लिए, एक समकणपरिक्षेपी प्रोटीन के एसईसी-एमएएलएस विश्लेषण से ज्ञात होगा कि पूरे शिखर में समान मोलर द्रव्यमान वाले अणु होते हैं, जो मानक एसईसी विश्लेषण के साथ संभव नहीं है।

एसएलएस के साथ ग्राम अणुक द्रव्यमान का निर्धारण करने के लिए एकाग्रता माप के साथ प्रकाश प्रकीर्णन माप के संयोजन की आवश्यकता होती है। इसलिए एसईसी-एमएएलएस में सामान्यतः प्रकाश प्रकीर्णन संसूचक और या तो एक अंतर अपवर्तनांकमापी या यूवी / विस अवशोषण संसूचक सम्मिलित होता है। इसके अतिरिक्त, एमएएलएस एक निश्चित आकार सीमा से ऊपर के अणुओं के आरएमएस त्रिज्या Rg को निर्धारित करता है, सामान्यतः 10 एनएम। इसलिए एसईसी-एमएएलएस ग्राम अणुक द्रव्यमान से Rg के संबंध के माध्यम से बहुलक की रचना का विश्लेषण कर सकते हैं। छोटे अणुओं के लिए, या तो डीएलएस या, अधिक सामान्य रूप से, द्रवगतिकीय त्रिज्या निर्धारित करने के लिए एक अंतर श्यानतामापी जोड़ा जाता है और उसी प्रकार आणविक संरचना का मूल्यांकन करता है।

एसईसी-डीएलएस में, बृहद् अणु के आकार को मापा जाता है क्योंकि वे आकार अपवर्जन स्तंभ समूह से डीएलएस उपकरण के प्रवाह कक्ष में प्रवेश करते हैं। अणुओं या कणों के द्रवगतिकीय आकार को मापा जाता है न कि उनके आणविक भार को। प्रोटीन के लिए द्रवगतिकीय आकार से आणविक भार का अनुमान लगाने के लिए मार्क-हौविंक प्रकार की गणना का उपयोग किया जा सकता है।

एसईसी के साथ मिलकर डीएलएस का एक प्रमुख लाभ बढ़ा हुआ डीएलएस स्थिरता प्राप्त करने की क्षमता है। वर्ग डीएलएस त्वरित और सरल है और औसत आकार का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है, परन्तु डीएलएस का आधारभूत स्थिरता व्यास में 3:1 का अनुपात है। एसईसी का उपयोग करते हुए, प्रोटीन और प्रोटीन ओलिगोमर्स को अलग किया जाता है, जिससे ओलिगोमेरिक स्थिरता की अनुमति मिलती है। एएसईसी का उपयोग करके एकत्रीकरण अध्ययन भी किया जा सकता है। यद्यपि समग्र एकाग्रता की गणना प्रकाश प्रकीर्णन के साथ नहीं की जा सकती है(एक ऑनलाइन एकाग्रता संसूचक जैसे कि ग्राम अणुक द्रव्यमान माप के लिए एसईसी-एमएएलएस में उपयोग किया जाता है, जो कुल एकाग्रता को भी निर्धारित करता है), समुच्चय का आकार मापा जा सकता है, मात्र एसईसी स्तंभ से निकलने वाले अधिकतम आकार द्वारा सीमित किया जा सकता है।

डीएलएस पहचान के साथ एएसईसी की सीमाओं में प्रवाह-दर, एकाग्रता और वास्तविकता सम्मिलित है। क्योंकि एक सहसंबंध कार्य को ठीक से बनाने के लिए कहीं भी 3-7 सेकंड की आवश्यकता होती है, इसलिए शिखर पर सीमित संख्या में आंकड़े बिंदु एकत्र किए जा सकते हैं। एसएलएस पहचान के साथ एएसईसी प्रवाह दर से सीमित नहीं है और माप समय अनिवार्य रूप से तात्कालिक है, और एकाग्रता की सीमा डीएलएस की तुलना में परिमाण के कई क्रम हैं। यद्यपि, एसईसी-एमएएलएस के साथ ग्राम अणुक द्रव्यमान विश्लेषण के लिए वास्तविक एकाग्रता माप की आवश्यकता होती है। एसईसी द्वारा पृथक्करण के बाद अधिक व्यापक पूर्ण विश्लेषण के लिए एमएएलएस और डीएलएस संसूचकों को प्रायः एक ही उपकरण में जोड़ा जाता है।

यह भी देखें

 * पेगिलेशन
 * जेल निस्पंदन वर्णलेखन
 * प्रोटीन शुद्धिकरण

बाहरी संबंध
Gel-Permeations-Chromatografie クロマトグラフィー