लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

लेज़र अधिकृत सूक्ष्मविच्छेदन (LCM), जिसे सूक्ष्मविच्छेदन, लेज़र सूक्ष्मविच्छेदन (LMD), या लेज़र-सहाय प्रदत्त सूक्ष्मविच्छेदन (एलएमडी (LMD) या एलएएम (LAM)) भी कहा जाता है, ऊतक/कोशिकाओं/जीवों के सूक्ष्मदर्शीय क्षेत्रों (लेजर की सहायता से सूक्ष्मदर्शीय पैमाने पर विच्छेदन) से विशिष्ट कोशिकाओं को अलग करने की एक विधि है।

सिद्धांत
लेज़र-अधिकृत सूक्ष्मविच्छेदन (एलसीएम) प्रत्यक्ष सूक्ष्मदर्शीय दृश्य के तहत ऊतक कोशिकाओं की उप-जनसंख्या प्राप्त करने की एक विधि है। एलसीएम (LCM) तकनीक प्रेरित कोशिकाओं को सीधे प्राप्त कर सकती है या विशिष्ट कोशिकाओं को हिस्टोलॉजिकल रूप से शुद्ध समृद्ध कोशिका जनसंख्या देने के लिए अवांछित कोशिकाओं को काटकर अलग कर सकती है। विभिन्न प्रकार के अनुप्रवाह अनुप्रयोग उपस्थित हैं- डीएनए (DNA) जीनोटाइपिंग और विषमयुग्मजता (एलओएच(LOH)) विश्लेषण, आरएनए(RNA) प्रतिलेख रूपरेखा, सीडीएनए (cDNA) लाइब्रेरी जनरेशन, प्रोटीन संजीनिकी (प्रोटिओमिक्स) खोज और संकेत-मार्ग रूपरेखा। इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए आवश्यक कुल समय प्रायः 1-1.5 घंटे होता है।

निष्कर्षण
लेज़र को सूक्ष्मदर्शी में जोड़ा जाता है और स्लाइड पर ऊतक पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। प्रकाशिकी या अवस्था द्वारा लेजर की गति से फोकस प्रक्षेपवक्र का अनुसरण करता है जो उपयोगकर्ता द्वारा पूर्वनिर्धारित होता है। यह प्रक्षेपवक्र, जिसे तत्व भी कहा जाता है, को काटकर आसन्न ऊतक से अलग कर दिया जाता है। काटने की प्रक्रिया के बाद, निष्कर्षण प्रक्रिया वांछित होने पर निष्कर्षण प्रक्रिया का पालन करना पड़ता है। अधिक हाल की प्रौद्योगिकियां गैर-संपर्क सूक्ष्म विच्छेदन का उपयोग करती हैं।

ऊतकविकृतिविज्ञान के नमूने के साथ सूक्ष्मदर्शी स्लाइड से ऊतक निकालने के कई तरीके हैं। नमूने पर चिपचिपी सतह को दबाएं और फाड़ दें। यह वांछित क्षेत्र को निकालता है, लेकिन सतह पर उपस्थित कणों या अवांछित ऊतकों को भी हटा सकता है, क्योंकि सतह चयनात्मक नहीं है। नमूने पर प्लास्टिक झिल्ली को पिघलाएं और फाड़ दें। उष्मा, उदाहरण के लिए, लाल या अवरक्त विकिरण (IR) लेसर द्वारा अवशोषी रंजक से अभिरंजित झिल्ली पर डाली जाती है। जैसा कि यह झिल्ली पर वांछित नमूने का पालन करता है, जैसा कि किसी भी झिल्ली के साथ होता है जिसे ऊतकविकृतिविज्ञान नमूना सतह के समीप रखा जाता है, वहां से कुछ मलबे को निकाला जा सकता है। एक और खतरा प्रारम्भ की गई उष्मा है- डीएनए (DNA), आरएनए (RNA), या प्रोटीन जैसे कुछ अणु जितना संभव हो उतना शुद्ध रूप से पृथक होने के लक्ष्य के लिए बहुत अधिक गर्म होने की अनुमति नहीं देते हैं।

परिवहन के लिए बिना संपर्क के। तीन अलग-अलग दृष्टिकोण हैं। सरल सूक्ष्मदर्शी (जिसे जीएएम (GAM), गुरुत्वाकर्षण-सहायता प्राप्त सूक्ष्मविच्छेदन कहा जाता है) का उपयोग करके गुरुत्वाकर्षण द्वारा परिवहन या लेजर दबाव अवक्षेपक द्वारा परिवहन नवीनतम पीढ़ी लेजर प्रेरित अग्रसर स्थानांतरण (LIFT) पर आधारित तकनीक का उपयोग करती है। कट-एंड-कैप्चर के साथ, चिपकने वाला लेपित आवरण सीधे पतले कटे (5-8 माइक्रोन (μm)) ऊतक खंड पर स्थित होता है, अनुभाग स्वयं एक पतली झिल्ली (पॉलीइथाइलीन नेफ़थलीन) पर टिका होता है। आईआर (IR) लेजर धीरे-धीरे आवरण पर चिपकने वाले को अंतर्निहित ऊतक में संगलित कर देता है और यूवी (UV) लेजर ऊतक और अंतर्निहित झिल्ली के माध्यम से कट जाता है। झिल्ली-ऊतक इकाई अब आवरण का पालन करती है और आवरण पर कोशिकाओं का उपयोग अनुप्रवाह अनुप्रयोगों (डीएनए (DNA), आरएनए (RNA), प्रोटीन विश्लेषण) में किया जा सकता है।

प्रक्रिया
सॉफ्टवेयर इंटरफेस का उपयोग कर सूक्ष्मदर्शी के तहत, एक ऊतक खंड (प्रायः 5-50 माइक्रोमीटर मोटा) देखा जाता है और अलग-अलग कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों को या तो मैन्युअल रूप से या अर्ध-स्वचालित या अधिक पूरी तरह से स्वचालित तरीकों से पहचाना जाता है जिससे प्रतिबिंबन की अनुमति मिलती है और फिर पृथक्करण के लिए लक्ष्यों का स्वत: चयन होता है। वर्तमान में कोशिका पृथक्करण के लिए सूक्ष्मदर्शी और उपकरण का उपयोग करके छह प्राथमिक पृथक्करण/संग्रह प्रौद्योगिकियां उपस्थित हैं। इनमें से चार प्रायः सीधे ऊतकों या झिल्ली/फिल्म को काटने के लिए पराबैंगनी स्पंदित लेजर (355 एनएम(nm)) का उपयोग करते हैं, और कभी-कभी आईआर (IR) लेजर के संयोजन में कोशिका आसंजन और पृथक्करण के लिए चिपचिपे बहुलक को गर्म करने/पिघलने के लिए जिम्मेदार होते हैं। आईआर (IR) लेज़र सूक्ष्मविच्छेदन के लिए अधिक सौम्य दृष्टिकोण प्रदान करता है। पांचवीं पराबैंगनी लेजर आधारित तकनीक ऊर्जा हस्तांतरण विलेपन के साथ लेपित विशेष स्लाइडों का उपयोग करती है, जो लेजर पल्स द्वारा सक्रिय होने पर, ऊतक या कोशिकाओं को संग्रह आवरण में ले जाती है।

लेजर काटने की चौड़ाई प्रायः 1 माइक्रोन (μm) से कम होती है, इस प्रकार लेजर बीम से लक्षित कोशिकाएं प्रभावित नहीं होती हैं। यहां तक कि जीवित कोशिकाएं भी लेजर कटिंग से क्षतिग्रस्त नहीं होती हैं और प्रतिरूपण और पुनः संवर्धन के लिए काटने के बाद उपयुक्त रूप से व्यवहार्य होती हैं।

विभिन्न प्रौद्योगिकियां संग्रह प्रक्रिया, संभावित प्रतिबिंबन विधियों (प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शिकी / उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्मदर्शिकी / अंतर हस्तक्षेप विपरीत सूक्ष्मदर्शिकी / चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शिकी / आदि) और प्रतिबिंबन और पृथक्करण से पहले आवश्यक धारकों और ऊतक की तैयारी में भिन्न होती हैं। अधिकांश मुख्य रूप से समर्पित सूक्ष्म-विच्छेदन प्रणालियां हैं, और कुछ का उपयोग अनुसंधान सूक्ष्मदर्शी के रूप में भी किया जा सकता है, केवल तकनीक (यहां #2, लीका) सरल सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करती है, कुछ नमूना संचालन क्षमताओं को कुछ हद तक सीमित करती है, विशेष रूप से जीवित कोशिका कार्य के लिए।

प्रथम तकनीक (कार्ल ज़ीस पीएएलएम (PALM) द्वारा प्रयुक्त) नमूने के चारों ओर काटती है और फिर इसे "अवक्षेपकीकरण" तकनीक द्वारा एकत्र करती है। नमूने को स्लाइड या विशेष संवर्धन डिश से डिफोकस किए गए यूवी (UV) लेजर पल्स द्वारा अवक्षेपक किया जा सकता है जो स्लाइड / डिश से पदार्थ को आगे बढ़ाने के लिए फोटोनिक बल उत्पन्न करता है, एक तकनीक जिसे कभी-कभी लेजर सूक्ष्म-विच्छेदन दबाव अवक्षेपकीकरण (कैटापुलिंग (एलएमपीसी) कहा जाता है। विच्छेदित पदार्थ को एक माइक्रोफ्यूज नलिका आवरण या अन्य संग्राहक में ऊपर की ओर (कई मिलीमीटर तक) भेजा जाता है जिसमें या तो उभयरोधी या नलिका आवरण में विशेष चिपचिपा पदार्थ होता है जिसका ऊतक पालन करेगा। यह सक्रिय अवक्षेपक लगाने की प्रक्रिया झिल्ली-लेपित स्लाइडों का उपयोग करते समय कुछ स्थैतिक समस्याओं से बचाती है।

अन्य प्रक्रिया गुरुत्वाकर्षण-सहायता प्राप्त सूक्ष्मविच्छेदन विधि का अनुसरण करती है जो उपयोग की गई स्लाइड के तहत नलिका आवरण में नमूने एकत्र करने के लिए गुरुत्वाकर्षण को चालू करती है (आईओएन (ION) एलएमडी (LMD) प्रणाली, जुंगवू एफएंडबी (F&B) द्वारा उपयोग किया जाता है)। इस प्रणाली की स्थिति में, यह लेजर बीम को स्थिर रखते हुए, प्रेरित कोशिकाओं को काटने के लिए मोटरयुक्त चरण को स्थानांतरित करता है। और प्रणाली 355 एनएम (nm) ठोस-अवस्था लेजर (यूवी-ए) का उपयोग करती है जो आरएनए (RNA) या डीएनए (DNA) क्षति के बिना ऊतकों को काटने का सबसे सुरक्षित तरीका है।

एक अन्य निकट से संबंधित एलसीएम (LCM) प्रक्रिया (लीका द्वारा प्रयुक्त) ऊपर से नमूना काटती है और नमूना नमूना के नीचे अधिकृत उपकरण में गुरुत्वाकर्षण (गुरुत्वाकर्षण-सहायता प्राप्त सूक्ष्मविच्छेदन) के माध्यम से गिरता है। ऊपर एक के साथ अलग बिंदु है, यहाँ लेजर बीम द्विवर्णी दर्पण को घुमाकर ऊतक को काटने के लिए जा रहा है।

जब पसंद की कोशिका (स्लाइड या विशेष संवर्धन डिश पर) देखने के क्षेत्र के केंद्र में होती हैं, तो ऑपरेटर उपकरण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रेरित कोशिका का चयन करता है। क्षेत्र को पृथ्क किया जाना चाहिए जब एक निकट-आईआर (IR) लेजर ऊतक के नमूने पर रखे आवरण पर स्थानांतरण फिल्म को सक्रिय करने के लिए, चिपकने वाले को पिघला देता है जो फिल्म को पसंद की अंतर्निहित कोशिकाओं के साथ संगलित करता है (आर्कटुरस प्रणाली देखें) और/या प्रेरित कोशिका को काटने के लिए यूवी (UV) लेजर को सक्रिय करता है। कोशिकाओं को तब पतले ऊतक खंड से हटा दिया जाता है, जिससे सभी अवांछित कोशिकाएं पीछे रह जाती हैं। प्रेरित कोशिकाओं को तब निष्कर्षण से पहले देखा और प्रलेखित किया जाता है।

चौथी यूवी (UV) आधारित तकनीक (आण्विक मशीनों और उद्योगों एजी द्वारा प्रयुक्त) यहां तीसरी तकनीक के लिए थोड़ा अंतर प्रदान करती है, जिसमें अनिवार्य रूप से स्लाइड> नमूना> और झिल्ली के साथ एक प्रकार का सैंडविच बनाकर फ्रेम स्लाइड के उपयोग से नमूना पर निर्भर करती है जिसकी झिल्ली सतह लेजर द्वारा काटी जाती है और अंततः एक विशेष चिपकने वाले आवरण द्वारा ऊपर से उठाया जाता है।

पाँचवीं यूवी (UV) आधारित तकनीक निष्क्रिय ऊर्जा स्थानान्तरण विलेपन और यूवी (UV) आधारित लेजर सूक्ष्मविच्छेदन प्रणाली (प्रायः लीका एलएमडी (LMD) या पीएएलएम (PALM) ज़ीस मशीन) के साथ लेपित मानक काँच स्लाइड का उपयोग करती है। ऊर्जा स्थानान्तरण विलेपन के शीर्ष पर ऊतक खंड लगाए गए हैं। यूवी (UV) लेजर से ऊर्जा को विलेपन पर प्रहार करने, इसे वाष्पीकृत करने, संग्रह नलिका में चयनित ऊतक सुविधाओं को तुरंत प्रेरित करने पर गतिज ऊर्जा में परिवर्तित किया जाता है। एक्सप्रेशन पैथोलॉजी इंक. (रॉकविले, एमडी (MD)) द्वारा ट्रेड नाम डायरेक्टर (DIRECTOR) स्लाइड्स के तहत व्यावसायीकृत ऊर्जा स्थानान्तरण विलेपित स्लाइड्स, प्रोटिओमिक कार्य के लिए कई लाभ प्रदान करती हैं। वे स्व प्रतिदीप्‍ति भी नहीं करते हैं, इसलिए उनका उपयोग प्रतिदीप्त दाग, डीआईसी (DIC) या ध्रुवीकृत प्रकाश का उपयोग करने वाले अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

ऊतक वर्गों के अलावा, एलसीएम (LCM) जीवित कोशिकाओं/जीवों, कोशिका अस्पष्ट, गुणसूत्र तैयारियों और पौधे के ऊतकों पर किया जा सकता है।

अनुप्रयोग
लेज़र अधिकृत सूक्ष्मविच्छेदन प्रक्रिया एकत्र किए गए नमूने की आकृति विज्ञान और रसायन विज्ञान को परिवर्तित या क्षति नहीं पहुँचाती है, न ही आसपास की कोशिकाओं को हानि पहुंचाती है। इस कारण से, एलसीएम (LCM) डीएनए (DNA), आरएनए (RNA) और/या प्रोटीन विश्लेषण के लिए चयनित कोशिकाओं को एकत्रित करने की एक उपयोगी विधि है। एलसीएम (LCM) का उपयोग अकोशिकीय संरचनाओं को अलग करने के लिए भी किया गया है, जैसे एमिलॉयड परतें एलसीएम (LCM) विभिन्न प्रकार के ऊतक के नमूनों पर किया जा सकता है जिसमें रक्त अस्पष्ट, कोशिकीय तैयारी, कोशिका संवर्धनों और ठोस ऊतक के विभाज्य सम्मिलित हैं। जमे हुए और पैराफिन अंतर्निहित अभिलेखीय ऊतक का भी उपयोग किया जा सकता है।

बाहरी संबंध

 * East Carolina University: LCM for "Dummies"
 * Yale Rice Transcriptional Atlas Project employing Laser Capture Microdissection