जीन नॉकआउट

जीन नॉकआउट (जिसे जीन विलोपन या जीन निष्क्रियता के रूप में भी जाना जाता है) एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक है जिसमें किसी जीव के जीनोम के भीतर एक विशिष्ट जीन को हटाने या निष्क्रिय करने के लिए जीन लक्ष्यीकरण शामिल है। यह विभिन्न तरीकों के माध्यम से किया जा सकता है, जिसमें समजात पुनर्संयोजन, सीआरआईएसपीआर जीन संपादन|सीआरआईएसपीआर-कैस9, और ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे प्रभावकार न्यूक्लीज़ शामिल हैं।

जीन नॉकआउट के मुख्य लाभों में से एक यह है कि वे शोधकर्ताओं को विवो में एक विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने और सामान्य विकास और शरीर विज्ञान के साथ-साथ रोगों के विकृति विज्ञान में जीन की भूमिका को समझने की अनुमति देते हैं। नॉक आउट जीन के साथ जीव के फेनोटाइप का अध्ययन करके, शोधकर्ता उन जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं जिनमें जीन शामिल है।

जीन नॉकआउट के दो मुख्य प्रकार हैं: पूर्ण और सशर्त। एक पूर्ण जीन नॉकआउट स्थायी रूप से जीन को निष्क्रिय कर देता है, जबकि एक सशर्त जीन नॉकआउट जीन को विशिष्ट समय पर या विशिष्ट ऊतकों में बंद और चालू करने की अनुमति देता है। सशर्त नॉकआउट विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने और विशिष्ट कोशिका प्रकारों या ऊतकों में जीन की भूमिका को समझने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं।

बैक्टीरिया, यीस्ट, फल मक्खियाँ, ज़ेब्राफिश और चूहों सहित कई अलग-अलग जीवों में जीन नॉकआउट का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। चूहों में, जीन नॉकआउट का उपयोग आमतौर पर विकास, शरीर विज्ञान और कैंसर अनुसंधान में विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

माउस मॉडल में जीन नॉकआउट का उपयोग मानव रोगों के अध्ययन में विशेष रूप से मूल्यवान रहा है। उदाहरण के लिए, चूहों में जीन नॉकआउट का उपयोग कैंसर, तंत्रिका संबंधी विकारों, प्रतिरक्षा विकारों और चयापचय संबंधी विकारों में विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया गया है।

हालाँकि, जीन नॉकआउट की भी कुछ सीमाएँ हैं। उदाहरण के लिए, एक जीन की हानि पूरी तरह से आनुवंशिक विकार के प्रभावों की नकल नहीं कर सकती है, और नॉकआउट का अन्य जीन या मार्गों पर अनपेक्षित प्रभाव हो सकता है। इसके अतिरिक्त, जीन नॉकआउट हमेशा मानव रोग के लिए एक अच्छा मॉडल नहीं होता है क्योंकि माउस जीनोम मानव जीनोम के समान नहीं होता है, और माउस फिजियोलॉजी मानव फिजियोलॉजी से अलग होती है।

केओ तकनीक मूलतः जीन नॉक-इन के विपरीत है। किसी जीव में एक साथ दो जीनों को ख़त्म करना डबल नॉकआउट (DKO) के रूप में जाना जाता है। इसी प्रकार ट्रिपल नॉकआउट (टीकेओ) और क्वाड्रपल नॉकआउट (क्यूकेओ) शब्द का उपयोग क्रमशः तीन या चार नॉक आउट जीन का वर्णन करने के लिए किया जाता है। हालाँकि, किसी को युग्मनजता  केओ के बीच अंतर करने की आवश्यकता है। पहले में, दो जीन प्रतियों (जेनेटिक तत्व) में से केवल एक को बाहर कर दिया जाता है, बाद में दोनों को बाहर कर दिया जाता है।

तरीके
नॉकआउट विभिन्न तकनीकों के माध्यम से पूरा किया जाता है। मूल रूप से, स्वाभाविक रूप से होने वाले उत्परिवर्तन की पहचान की गई और फिर डीएनए अनुक्रमण या अन्य तरीकों से जीन हानि या निष्क्रियता को स्थापित किया जाना था।

उत्परिवर्तन द्वारा जीन नॉकआउट
उत्परिवर्तन द्वारा जीन नॉकआउट आमतौर पर बैक्टीरिया में किया जाता है। एस्चेरिचिया कोली में इस तकनीक के उपयोग का एक प्रारंभिक उदाहरण 1989 में हैमिल्टन, एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था। इस प्रयोग में, जीन को हटाने के लिए दो अनुक्रमिक पुनर्संयोजन का उपयोग किया गया। इस कार्य ने बैक्टीरिया में एक कार्यात्मक जीन को हटाने या बदलने की व्यवहार्यता स्थापित की। तब से यह विधि अन्य जीवों, विशेष रूप से चूहों जैसे अनुसंधान जानवरों के लिए विकसित की गई है। नॉकआउट चूहों का उपयोग आमतौर पर मानव समकक्षों के साथ जीन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जो बीमारी के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। नॉकआउट चूहों का उपयोग करते हुए एक अध्ययन का एक हालिया उदाहरण चेंग, एट अल द्वारा चीनी हान आबादी में अचानक अस्पष्टीकृत रात्रि मृत्यु सिंड्रोम (एसयूएनडीएस) और ब्रुगाडा सिंड्रोम में ज़िरप प्रोटीन की भूमिका की जांच है।

जीन साइलेंसिंग
जीन नॉकआउट जांच के लिए, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), एक हालिया विधि, जिसे जीन साइलेंसिंग के रूप में भी जाना जाता है, ने लोकप्रियता हासिल की है। आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) में, एक विशेष जीन के लिए मैसेंजर आरएनए को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (siRNA) या छोटे हेयरपिन आरएनए (shRNA) का उपयोग करके निष्क्रिय किया जाता है। यह प्रभावी रूप से जीन को व्यक्त होने से रोकता है। बीसीएल-2 और पी53 जैसे ऑन्कोजीन, साथ ही न्यूरोलॉजिकल रोग, आनुवंशिक विकार और वायरल संक्रमण से जुड़े जीन, सभी को आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) का उपयोग करके जीन साइलेंसिंग के लिए लक्षित किया गया है।

सजातीय पुनर्संयोजन
समजात पुनर्संयोजन दो डीएनए स्ट्रैंड के बीच जीन का आदान-प्रदान है जिसमें आधार अनुक्रमों के व्यापक क्षेत्र शामिल होते हैं जो एक दूसरे के समान होते हैं। यूकेरियोटिक प्रजातियों, बैक्टीरिया और कुछ वायरस में, समजात पुनर्संयोजन अनायास होता है और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर में एक उपयोगी उपकरण है। सजातीय पुनर्संयोजन, जो यूकेरियोट्स में अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होता है, डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टूटने की मरम्मत के लिए आवश्यक है और क्रोमोसोमल क्रॉसिंग के दौरान आनुवंशिक जानकारी के आंदोलन की अनुमति देकर आनुवंशिक भिन्नता को बढ़ावा देता है। सजातीय पुनर्संयोजन, बैक्टीरिया में एक प्रमुख डीएनए मरम्मत तंत्र, जीन के क्षैतिज स्थानांतरण और डीएनए में परिवर्तन के माध्यम से प्राप्त आनुवंशिक सामग्री को सम्मिलित करने में सक्षम बनाता है। वायरस में सजातीय पुनर्संयोजन वायरल विकास के पाठ्यक्रम को प्रभावित करता है। होमोलॉगस पुनर्संयोजन, आनुवंशिक इंजीनियरिंग में उपयोग किया जाने वाला एक प्रकार का जीन लक्ष्यीकरण, उस जीन के कार्य के बारे में अधिक जानने के लिए एक विशेष जीन में एक इंजीनियर उत्परिवर्तन की शुरूआत शामिल है। इस विधि में विदेशी डीएनए को एक कोशिका में सम्मिलित करना शामिल होता है जिसका अनुक्रम लक्ष्य जीन के समान होता है, जबकि अनुक्रमों से घिरा होता है जो लक्ष्य जीन के समान अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम होते हैं। लक्ष्य जीन के डीएनए को प्रतिकृति के दौरान विदेशी डीएनए अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है जब कोशिका समान फ़्लैंकिंग क्षेत्रों को होमोलॉग के रूप में पहचानती है। विनिमय द्वारा लक्ष्य जीन को नष्ट कर दिया जाता है। चूहों में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में विशेष एलील्स को लक्षित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करके, नॉकआउट चूहों का निर्माण संभव है। जीन लक्ष्यीकरण की सहायता से, कई माउस जीनों को बंद कर दिया गया है, जिससे कैंसर, मधुमेह, हृदय रोग और तंत्रिका संबंधी विकारों जैसे विभिन्न मानव रोगों के सैकड़ों अलग-अलग माउस मॉडल का निर्माण हुआ है। मारियो कैपेची, सर मार्टिन जे. इवांस और ओलिवर स्मिथीज़ ने माउस स्टेम कोशिकाओं में समजात पुनर्संयोजन पर अभूतपूर्व शोध किया, और उन्होंने अपने निष्कर्षों के लिए फिजियोलॉजी या मेडिसिन में 2007 का नोबेल पुरस्कार साझा किया। परंपरागत रूप से, जीन नॉकआउट पैदा करने के लिए सजातीय पुनर्संयोजन मुख्य तरीका था। इस विधि में वांछित उत्परिवर्तन युक्त डीएनए निर्माण शामिल है। नॉकआउट उद्देश्यों के लिए, इसमें आमतौर पर वांछित नॉकआउट जीन के स्थान पर एक दवा प्रतिरोध मार्कर शामिल होता है। निर्माण में लक्ष्य अनुक्रम के लिए न्यूनतम 2kb अनुक्रम समरूपता भी शामिल होगी। निर्माण को microinjection  या इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से स्टेम कोशिकाओं तक पहुंचाया जा सकता है। यह विधि डीएनए निर्माण को मौजूदा डीएनए में पुनः संयोजित करने के लिए कोशिका के स्वयं के मरम्मत तंत्र पर निर्भर करती है। इसके परिणामस्वरूप जीन का अनुक्रम बदल जाता है, और अधिकांश मामलों में जीन का अनुवाद (आनुवांशिकी) एक गैर-कार्यात्मक प्रोटीन में हो जाएगा, यदि इसका बिल्कुल भी अनुवाद किया जाता है। हालाँकि, यह एक अप्रभावी प्रक्रिया है, क्योंकि सजातीय पुनर्संयोजन केवल 10 के लिए होता है−2 से 10-3 डीएनए एकीकरण।  अक्सर, निर्माण पर दवा चयन मार्कर का उपयोग उन कोशिकाओं के चयन के लिए किया जाता है जिनमें पुनर्संयोजन घटना हुई है।

इन स्टेम कोशिकाओं में अब जीन की कमी है, इन्हें प्रारंभिक भ्रूण में डालकर, उदाहरण के लिए चूहों मेंरहना में उपयोग किया जा सकता है। यदि परिणामी काइमेरिक माउस में उनकी रोगाणु रेखा में आनुवंशिक परिवर्तन होता है, तो इसे संतानों में पारित किया जा सकता है।

द्विगुणित जीवों में, जिनमें अधिकांश जीनों के लिए दो जेनेटिक तत्व  होते हैं, और साथ ही कई संबंधित जीन भी हो सकते हैं जो एक ही भूमिका में सहयोग करते हैं, परिवर्तन और चयन के अतिरिक्त दौर तब तक किए जाते हैं जब तक कि प्रत्येक लक्षित जीन बाहर नहीं निकल जाता। समयुग्मजी नॉकआउट जानवरों के उत्पादन के लिए चयनात्मक प्रजनन की आवश्यकता हो सकती है।

साइट-विशिष्ट न्यूक्लिअस
वर्तमान में तीन विधियाँ उपयोग में हैं जिनमें डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक शुरू करने के लिए डीएनए अनुक्रम को सटीक रूप से लक्षित करना शामिल है। एक बार ऐसा होने पर, सेल के मरम्मत तंत्र इस डबल स्ट्रैंडेड ब्रेक को ठीक करने का प्रयास करेंगे, अक्सर गैर-समजात अंत जुड़ाव (एनएचईजे) के माध्यम से, जिसमें सीधे दो कटे हुए सिरों को एक साथ जोड़ना शामिल होता है। यह अपूर्ण तरीके से किया जा सकता है, इसलिए कभी-कभी बेस जोड़े के सम्मिलन या विलोपन का कारण बनता है, जो फ्रेम शिफ्ट मुतसिओन  का कारण बनता है। ये उत्परिवर्तन उस जीन को निष्क्रिय कर सकते हैं जिसमें वे घटित होते हैं, इस प्रकार उस जीन को ख़त्म कर देते हैं। यह प्रक्रिया सजातीय पुनर्संयोजन की तुलना में अधिक कुशल है, और इसलिए इसे द्विवार्षिक नॉकआउट बनाने के लिए अधिक आसानी से उपयोग किया जा सकता है।

जिंक-उंगलियां
जिंक फिंगर न्यूक्लीज|जिंक-फिंगर न्यूक्लीज में डीएनए बाइंडिंग डोमेन होते हैं जो डीएनए अनुक्रम को सटीक रूप से लक्षित कर सकते हैं। प्रत्येक जिंक उंगली वांछित डीएनए अनुक्रम के कोडन को पहचान सकती है, और इसलिए इसे एक विशेष अनुक्रम से बांधने के लिए मॉड्यूलर रूप से इकट्ठा किया जा सकता है। ये बाइंडिंग डोमेन एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ जुड़े हुए हैं जो डीएनए में डबल स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) का कारण बन सकता है। मरम्मत प्रक्रियाएँ उत्परिवर्तन उत्पन्न कर सकती हैं जो जीन की कार्यक्षमता को नष्ट कर देती हैं।

प्रतिभा
ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-लाइक इफ़ेक्टर न्यूक्लीज़ (TALENS) में एक डीएनए बाइंडिंग डोमेन और एक न्यूक्लीज़ भी होता है जो डीएनए को विभाजित कर सकता है। डीएनए बाइंडिंग क्षेत्र में अमीनो एसिड रिपीट होते हैं जो प्रत्येक वांछित लक्षित डीएनए अनुक्रम की एकल आधार जोड़ी को पहचानते हैं। यदि इस दरार को जीन कोडिंग क्षेत्र पर लक्षित किया जाता है, और एनएचजे-मध्यस्थता मरम्मत सम्मिलन और विलोपन का परिचय देती है, तो एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन अक्सर परिणामित होता है, इस प्रकार जीन के कार्य को बाधित करता है।

CRISPR/Cas9
CRISPR (क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) एक जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीक है जो जीनोम के सटीक संपादन की अनुमति देती है। सीआरआईएसपीआर का एक अनुप्रयोग जीन नॉक-आउट है, जिसमें किसी जीव में एक विशिष्ट जीन को अक्षम करना या बाहर करना शामिल है।

सीआरआईएसपीआर के साथ जीन नॉक-आउट की प्रक्रिया में तीन मुख्य चरण शामिल हैं: एक गाइड आरएनए (जीआरएनए) डिजाइन करना जो जीनोम में एक विशिष्ट स्थान को लक्षित करता है, जीआरएनए और एक कैस9 एंजाइम (जो आणविक कैंची के रूप में कार्य करता है) को लक्ष्य कोशिका तक पहुंचाता है, और फिर कोशिका को डीएनए में कटौती की मरम्मत करने की अनुमति देता है। जब कोशिका कट की मरम्मत करती है, तो यह या तो कटे हुए सिरों को वापस एक साथ जोड़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-कार्यात्मक जीन बन सकता है, या एक उत्परिवर्तन उत्पन्न कर सकता है जो जीन के कार्य को बाधित करता है।

इस तकनीक का उपयोग बैक्टीरिया, यीस्ट, पौधों और जानवरों सहित विभिन्न प्रकार के जीवों में किया जा सकता है, और यह वैज्ञानिकों को उनकी अनुपस्थिति के प्रभावों को देखकर विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने की अनुमति देता है। सीआरआईएसपीआर-आधारित जीन नॉक-आउट बीमारी के आनुवंशिक आधार को समझने और नए उपचार विकसित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सीआरआईएसपीआर-आधारित जीन नॉक-आउट, किसी भी आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक की तरह, जीव पर अनपेक्षित या हानिकारक प्रभाव पैदा करने की क्षमता रखता है, इसलिए इसका उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। युग्मित Cas9 डीएनए में डबल स्ट्रैंडेड ब्रेक का कारण बनेगा। जिंक-फिंगर और टैलेन के समान सिद्धांत का पालन करते हुए, इन डबल स्ट्रैंडेड ब्रेक की मरम्मत के प्रयासों के परिणामस्वरूप अक्सर फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन होता है जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-कार्यात्मक जीन होता है।

खटखटाना
जीन नॉकिन जीन नॉकआउट के समान है, लेकिन यह एक जीन को हटाने के बजाय दूसरे जीन से बदल देता है।

सशर्त नॉकआउट
एक सशर्त जीन नॉकआउट एक ऊतक में जीन को विशिष्ट तरीके से हटाने की अनुमति देता है। यह जीन नॉकआउट के स्थान पर आवश्यक है यदि अशक्त उत्परिवर्तन से भ्रूण की मृत्यु हो जाती है, या एक विशिष्ट ऊतक या कोशिका प्रकार विशिष्ट रुचि का है। यह जीन के चारों ओर लॉक्सपी साइट्स नामक लघु अनुक्रम पेश करके किया जाता है। इन अनुक्रमों को नॉक-आउट के समान तंत्र के माध्यम से जर्म-लाइन में पेश किया जाएगा। इस रोगाणु-रेखा को फिर Cre recombinase युक्त एक अन्य रोगाणु रेखा तक पार किया जा सकता है | Cre-recombinase जो एक वायरल एंजाइम है जो इन अनुक्रमों को पहचान सकता है, उन्हें पुनः संयोजित कर सकता है और इन साइटों से जुड़े जीन को हटा सकता है।

प्रारंभिक विकास में शामिल नहीं होने वाले जीनों का जीन विलोपन का उपयोग करने वाले नॉकआउट दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रभावी ढंग से अध्ययन किया गया है। हालाँकि, आमतौर पर उन जीनों को खत्म करना संभव नहीं है जो जीव के घातक परिणाम के बिना प्रारंभिक विकास के दौरान सक्रिय होते हैं। इसके इर्द-गिर्द एक तरीका सशर्त नॉकआउट है। Cre नामक साइट-विशिष्ट रीकॉम्बिनेज़ का उपयोग करते हुए, मूल सशर्त नॉकआउट तकनीक ने LoxP के रूप में जाने जाने वाले लघु लक्ष्य अनुक्रमों को पुनः संयोजित किया। तब से, अन्य पुनः संयोजक बनाए गए हैं और सशर्त नॉकआउट प्रयोगों में नियोजित किए गए हैं।

उपयोग
नॉकआउट का उपयोग मुख्य रूप से एक विशिष्ट जीन या डीएनए क्षेत्र की भूमिका को समझने के लिए किया जाता है, जिसमें नॉकआउट जीव की तुलना समान आनुवंशिकता पृष्ठभूमि वाले जंगली प्रकार से की जाती है।

नॉकआउट जीवों का उपयोग दवाओं के विकास में स्क्रीनिंग (चिकित्सा)दवा) उपकरण के रूप में भी किया जाता है, विशिष्ट नॉकआउट का उपयोग करके विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं या कमी (दवा) को लक्षित करने के लिए, या नॉकआउट जीवों की पुस्तकालय  का उपयोग करके दवा की कार्रवाई के तंत्र को समझने के लिए भी किया जाता है। संपूर्ण जीनोम को फैलाना, जैसे कि Saccharomyces cerevisiae में।

यह भी देखें

 * आवश्यक जीन
 * जीन नॉकडाउन
 * सशर्त जीन नॉकआउट
 * जर्मलाइन
 * जीन मौन
 * विलुप्त होना#योजनाबद्ध विलुप्ति
 * पुनर्संयोजन
 * मायोस्टैटिन
 * बेल्जियम नीला

बाहरी संबंध

 * Diagram of targeted gene replacement
 * Frontiers in Bioscience Gene Knockout Database (available on archive only)
 * International Knockout Mouse Consortium
 * KOMP Repository
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