फ्लोरोसेंट टैग

अणुजैविकी और जैवप्रौद्योगिकी में, फ्लोरोसेंट टैग, जिसे फ्लोरोसेंट लेबल या प्रतिदीप्ति जांच के रूप में भी जाना जाता है, यह एक अणु है जो प्रोटीन, एंटीबॉडी या अमीनो एसिड जैसे जैवाणु का पता लगाने में सहायता के लिए रासायनिक रूप से जुड़ा होता है। आम तौर पर, प्रतिदीप्ति टैगिंग, या लेबलिंग, एक फ्लोरोसेंट अणु के प्रतिक्रियाशील व्युत्पन्न का उपयोग करता है जिसे प्रतिदीप्तिधर (फ्लोरोफोरे) के रूप में जाना जाता है। फ्लोरोफोर चुनिंदा अणु पर विशिष्ट क्षेत्र या कार्यात्मक समूह को बांधता है और इसे रासायनिक या जैविक रूप से जोड़ा जा सकता है।  एंजाइमैटिक लेबलिंग, प्रोटीन लेबलिंग और जेनेटिक लेबलिंग जैसी विभिन्न लेबलिंग तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। ऐथिडियम ब्रोमाइड, फ्लोरेसिन और  ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन आम टैग हैं। सबसे अधिक लेबल किए जाने वाले अणु एंटीबॉडी, प्रोटीन, अमीनो एसिड और पेप्टाइड होते हैं जो तब किसी विशेष लक्ष्य का पता लगाने के लिए विशिष्ट जांच के रूप में उपयोग किए जाते हैं।

इतिहास
जैवाणु का पता लगाने और पहचानने के तरीकों का विकास आणविक संरचना और अन्योन्यक्रिया के अध्ययन में सुधार करने की क्षमता से प्रेरित है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आगमन से पहले, आणविक यौगिकों का पता लगाने और पहचानने के लिए विकिरण समस्थानिक का उपयोग किया जाता था। तब से, सुरक्षित तरीके विकसित किए गए हैं जिनमें जैवाणु को लेबल करने और पहचानने के साधन के रूप में प्रतिदीप्त रंजक या फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग टैग या जांच के रूप में शामिल है। हालाँकि इस संबंध में फ्लोरोसेंट टैगिंग का उपयोग हाल ही में किया गया है, लेकिन प्रतिदीप्ति की खोज काफी लंबे समय से है।

सर जॉर्ज स्टोक्स ने 1852 में प्रतिदीप्ति के स्टोक्स नियम को विकसित किया जिसमें कहा गया है कि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की तरंग दैर्ध्य रोमांचक विकिरण की तुलना में अधिक है। रिचर्ड मेयर ने 1897 में प्रतिदीप्ति से जुड़े रासायनिक समूह का वर्णन करने के लिए फ्लोरोफोर का नाम दिया। तब से, 1871 में एडॉल्फ वॉन बायर द्वारा फ्लोरेसिन को प्रतिदीप्त रंजक के रूप में बनाया गया था और 1911 में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के विकास के साथ धुंधला करने की विधि विकसित और उपयोग की गई थी।

1950 के दशक में एथिडियम ब्रोमाइड और परिवर्ती विकसित किए गए थे, और 1994 में, फ्लोरोसेंट प्रोटीन या एफपी पेश किए गए थे। 1960 के दशक में ओसामु शिमोमुरा द्वारा ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जीएफपी की खोज की गई थी और 1987 में डगलस प्रैशर द्वारा अनुरेखक अणु के रूप में विकसित किया गया था। एफपी ने आनुवंशिक प्रोटीन क्षेत्रों को चुनिंदा रूप से टैग करने और प्रोटीन कार्यों और तंत्रों का निरीक्षण करने की क्षमता के साथ लाइव सेल इमेजिंग की सफलता का नेतृत्व किया था। इस सफलता के लिए शिमोमुरा को 2008 में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था।

जैव-अणुओं पर नज़र रखने के लिए नए तरीके विकसित किए गए हैं जिनमें वर्णमिति बायोसेंसर, प्रकाशवर्णी यौगिक, जैवसामग्री और वैद्युतरासायनिक सेंसर शामिल हैं। फ्लोरोसेंट लेबलिंग भी एक सामान्य तरीका है जिसमें अनुप्रयोगों का विस्तार एंजाइमैटिक लेबलिंग, रासायनिक लेबलिंग, प्रोटीन टैग और जेनेटिक लेबलिंग तक हो गया है।



जैवाणु पर नज़र रखने के तरीके
जैवाणु पर नज़र रखने के लिए वर्तमान में कई लेबलिंग विधियाँ हैं। कुछ विधियों में निम्नलिखित शामिल हैं।

समस्थानिक (आइसोटोप) मार्कर
सामान्य प्रजातियां जिनमें आइसोटोप मार्करों का उपयोग प्रोटीन शामिल करने के लिए किया जाता है। इस मामले में, कार्बन, नाइट्रोजन या हाइड्रोजन के स्थिर समस्थानिक वाले अमीनो एसिड को पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम में शामिल किया जाता है। फिर इन पॉलीपेप्टाइड्स को द्रव्यमान स्पेक्ट्रममिति के माध्यम से डाला जाता है। सटीक परिभाषित परिवर्तन के कारण कि ये आइसोटोप पेप्टाइड्स पर होते हैं, स्पेक्ट्रोमेट्री ग्राफ के माध्यम से यह बताना संभव है कि पेप्टाइड्स में आइसोटोप शामिल हैं। ऐसा करने से, समूह में कई अन्य से लाभ के प्रोटीन को निकाला जा सकता है। फोटोक्रोम के रूप में समस्थानिक यौगिक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिनका वर्णन नीचे किया गया है।

वर्णमिति बायोसेंसर
बायोसेंसर लाभ के पदार्थ से जुड़े होते हैं। आम तौर पर, यह पदार्थ प्रकाश को अवशोषित करने में सक्षम नहीं होगा, लेकिन संलग्न बायोसेंसर के साथ, प्रकाश को अवशोषित किया जा सकता है और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर उत्सर्जित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट वाले बायोसेंसर को सामान्य आंखों से देखा जा सकता है। कुछ फ्लोरोसेंट बायोसेंसर में बदलते वातावरण में रंग बदलने की क्षमता भी होती है (उदा: नीले से लाल)। शोधकर्ता बायोसेंसर-अणु संकर प्रजातियों से किस रंग को स्पष्ट रूप से देख सकता है, इसके आधार पर आस-पास के वातावरण के बारे में डेटा का निरीक्षण और डेटा प्राप्त करने में सक्षम होता है।

वर्णमिति परख का उपयोग आम तौर पर यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि प्रजाति की दूसरी के सापेक्ष कितनी सांद्रता है।

प्रकाशवर्णी यौगिक
प्रकाशवर्णी यौगिकों में एक श्रेणी या रंगों की विविधता के बीच स्विच करने की क्षमता होती है। विभिन्न रंगों को प्रदर्शित करने की उनकी क्षमता इस बात पर निर्भर करती है कि वे प्रकाश को कैसे अवशोषित करते हैं। अणु के अलग-अलग आइसोमेरिक अभिव्यक्तियां प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य को अवशोषित करती हैं, ताकि प्रत्येक आइसोमेरिक प्रजाति अपने अवशोषण के आधार पर एक अलग रंग प्रदर्शित कर सके। इनमें फोटोविलेबल यौगिक शामिल हैं, जो प्रोटीन होते हैं जो एक गैर-फ्लोरोसेंट अवस्था से एक निश्चित वातावरण में एक फ्लोरोसेंट स्थिति में स्विच कर सकते हैं। फोटोक्रोम के रूप में उपयोग किया जाने वाला सबसे आम कार्बनिक अणु diarylethene है। फोटोस्विचेबल प्रोटीन के अन्य उदाहरणों में पैड्रॉन-सी, आरएस-फास्टलाइम-एस और बीएस-ड्रोनपा-एस शामिल हैं, जिनका उपयोग पौधे और स्तनधारी कोशिकाओं में समान रूप से किया जा सकता है ताकि कोशिकाओं को विभिन्न वातावरणों में स्थानांतरित किया जा सके।

जैव सामग्री
फ्लोरोसेंट बायोमैटेरियल्स बाहरी कारकों का उपयोग करने के लिए एक मार्ग को अधिक स्पष्ट रूप से देखने का एक संभावित तरीका है। विधि में पेप्टाइड अणुओं को फ्लोरोसेंटली लेबल करना शामिल है जो जीव के प्राकृतिक मार्ग को बदल देगा। जब इस पेप्टाइड को जीव की कोशिका में डाला जाता है, तो यह एक अलग प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है। इस पद्धति का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए एक रोगी का इलाज करने के लिए और फिर उपचार के परिणाम को स्पष्ट रूप से देखने के लिए।

विद्युत रासायनिक सेंसर
जैव-अणुओं के लेबल-मुक्त संवेदन के लिए वैद्युतरासायनिक सेंसर का उपयोग किया जा सकता है। वे परिवर्तनों का पता लगाते हैं और जांचे गए धातु इलेक्ट्रोड और लक्ष्य विश्लेषण वाले इलेक्ट्रोलाइट के बीच वर्तमान को मापते हैं। इलेक्ट्रोड के लिए एक ज्ञात क्षमता तब फीडबैक करंट से लागू की जाती है और परिणामी करंट को मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, वैद्युतरासायनिक सेंसिंग का उपयोग करने वाली एक तकनीक में वोल्टेज को धीरे-धीरे बढ़ाना शामिल है, जिससे इलेक्ट्रोड पर रासायनिक प्रजातियां ऑक्सीकृत या कम हो जाती हैं। सेल करंट बनाम वोल्टेज प्लॉट किया जाता है जो अंततः इलेक्ट्रोड पर खपत या उत्पादित रासायनिक प्रजातियों की मात्रा की पहचान कर सकता है। जैविक प्रणाली में पता लगाने में आसानी के लिए फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग वैद्युतरासायनिक सेंसर के संयोजन में किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट लेबल
जैवाणु को लेबल करने के विभिन्न तरीकों में से, फ्लोरोसेंट लेबल इस मायने में फायदेमंद होते हैं कि वे कम सांद्रता पर भी अत्यधिक संवेदनशील होते हैं और लक्ष्य अणु तह और कार्य के लिए गैर-विनाशकारी होते हैं।

ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेलिफ़िश एक्वोरिया विक्टोरिया से स्वाभाविक रूप से होने ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो व्यापक रूप से होता है लाभ के प्रोटीन को टैग करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रकाश के अवशोषण से उत्तेजित होने पर GFP प्रकाश स्पेक्ट्रम के हरे क्षेत्र में एक फोटॉन का उत्सर्जन करता है। क्रोमोफोर में एक β बैरल के भीतर स्थित ऑक्सीडाइज़्ड ट्राइपेप्टाइड -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 होता है। GFP ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करता है और केवल आणविक ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति के अन्य रंगों को शामिल करने के लिए अवशोषित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को बदलकर जीएफपी को संशोधित किया गया है। YFP या पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन, BFP या नीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और CFP या सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP परिवर्ती के उदाहरण हैं। ये परिवर्ती GFP जीन की जेनेटिक इंजीनियरिंग द्वारा निर्मित होते हैं। सिंथेटिक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग फ्लोरोसेंट लेबल के रूप में भी किया जा सकता है। इन लेबलों के लाभों में रंग में अधिक विविधता के साथ एक छोटा आकार शामिल है। उनका उपयोग रासायनिक मान्यता-आधारित लेबलिंग सहित विभिन्न तरीकों से लाभ के प्रोटीन को टैग करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि धातु-चेलेटिंग पेप्टाइड टैग का उपयोग करना, और जैविक पहचान-आधारित लेबलिंग एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करना। हालांकि, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ-साथ बेहतर स्थिरता के व्यापक सरणी के बावजूद, सिंथेटिक जांच सेल के लिए विषाक्त होती है और इसलिए आमतौर पर सेल इमेजिंग अध्ययन में उपयोग नहीं की जाती है।

एमआरएनए स्थानीयकरण जैसे अन्योन्यक्रिया और गतिविधि को देखने में मदद के लिए फ्लोरोसेंट लेबल को एमआरएनए में संकरणित किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया गया एक एंटीसेन्स स्ट्रैंड एक एकल एमआरएनए स्ट्रैंड से जुड़ा होता है, और फिर सेल के विकास के दौरान सेल के भीतर एमआरएनए के आंदोलन को देखने के लिए देखा जा सकता है।

फ्लोरोजेनिक लेबल
एक फ्लोरोजेन एक लिगैंड (फ्लोरोजेनिक लिगैंड) है जो स्वयं फ्लोरोसेंट नहीं है, लेकिन जब यह एक विशिष्ट प्रोटीन या आरएनए संरचना से बंधा होता है तो फ्लोरोसेंट हो जाता है। उदाहरण के लिए: fr: फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटिंग एंड एब्जॉर्प्शन-शिफ्टिंग टैग हेलोरोडोस्पिरा हेलोफिला#एप्लीकेशन का एक प्रकार है जिसे जीएफपी ट्राइपेप्टाइड क्रोमोफोर के रासायनिक नकल को बांधने के लिए तैयार किया गया था। इसी तरह, पालक aptamer एक इंजीनियर आरएनए अनुक्रम है जो GFP क्रोमोफोर रासायनिक नकल को बांध सकता है, जिससे अनुक्रम वाले आरएनए अणुओं पर सशर्त और प्रतिवर्ती प्रतिदीप्ति प्रदान करता है।

फ्लोरोसेंट लेबलिंग में टैग का प्रयोग
फ्लोरोसेंट लेबलिंग अपनी गैर-विनाशकारी प्रकृति और उच्च संवेदनशीलता के लिए जानी जाती है। इसने इसे जैव-अणुओं को लेबल करने और ट्रैक करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक बना दिया है। लक्ष्य की प्रकृति के आधार पर फ्लोरोसेंट लेबलिंग की कई तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है।

एंजाइमेटिक लेबलिंग
एंजाइमैटिक लेबलिंग में, एक जीन और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के डीएनए का उपयोग करते हुए, पहले एक डीएनए निर्माण किया जाता है। प्रतिलेखन के बाद, एक संकर आरएनए + फ्लोरोसेंट बनता है। ब्याज की वस्तु एक एंजाइम से जुड़ी है जो इस संकर डीएनए को पहचान सकती है। आमतौर पर फ्लोरेसिन का उपयोग फ्लोरोफोर के रूप में किया जाता है।

रासायनिक लेबलिंग
रासायनिक लेबलिंग या रासायनिक टैग का उपयोग एक छोटे अणु और एक विशिष्ट आनुवंशिक अमीनो एसिड अनुक्रम के बीच परस्पर क्रिया का उपयोग करता है। कभी-कभी जीएफपी के विकल्प के रूप में रासायनिक लेबलिंग का उपयोग किया जाता है। सिंथेटिक प्रोटीन जो फ्लोरोसेंट जांच के रूप में कार्य करते हैं, जीएफपी की तुलना में छोटे होते हैं, और इसलिए विभिन्न प्रकार की स्थितियों में जांच के रूप में कार्य कर सकते हैं। इसके अलावा, वे रंगों और फोटोकैमिकल गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करते हैं। रासायनिक लेबलिंग में हाल की प्रगति के साथ, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की विशेषता β-बैरल की वास्तुकला और आकार की सीमाओं के कारण फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर रासायनिक टैग को प्राथमिकता दी जाती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के परिवर्तन से फ्लोरोसेंट गुणों का नुकसान होगा।

प्रोटीन लेबलिंग
प्रोटीन तह और कार्य में व्यवधान को कम करने के लिए प्रोटीन लेबलिंग एक छोटे टैग का उपयोग करता है। संक्रमण धातुओं का उपयोग टैग में विशिष्ट अवशेषों को साइट-विशिष्ट लक्ष्यों जैसे एन-टर्मिनी, सी-टर्मिनी, या प्रोटीन के भीतर आंतरिक साइटों से जोड़ने के लिए किया जाता है। प्रोटीन लेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले टैग के उदाहरणों में बायर्सनिकल टैग, हिस्टडीन टैग और फ्लैग टैग शामिल हैं।

जेनेटिक लेबलिंग
सीटू संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति, एक आनुवंशिक लेबलिंग तकनीक का एक उदाहरण है जो उन जांचों का उपयोग करती है जो क्रोमोसोम की लंबाई के साथ क्रोमोसोमल साइटों के लिए विशिष्ट होती हैं, जिन्हें क्रोमोसोम पेंटिंग के रूप में भी जाना जाता है। एकाधिक प्रतिदीप्त रंजक जिनमें से प्रत्येक में एक अलग उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य होता है, एक जांच से बंधे होते हैं जो तब गुणसूत्रों के लिए संकरणित होता है। एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी मौजूद रंगों का पता लगा सकता है और इसे एक कंप्यूटर पर भेज सकता है जो कोशिका के कैरियोटाइप को प्रकट कर सकता है। यह तकनीक विलोपन और दोहराव जैसी असामान्यताओं को प्रकट करने की अनुमति देती है।

सेल इमेजिंग
फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तुलना में रासायनिक टैग इमेजिंग तकनीकों के लिए अधिक तैयार किए गए हैं क्योंकि रासायनिक टैग फोटोसेंसिटाइज़र को लक्ष्य प्रोटीन के करीब स्थानीयकृत कर सकते हैं। प्रोटीन को तब सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, कैल्शियम इमेजिंग | सीए जैसे इमेजिंग के साथ लेबल और पता लगाया जा सकता है2+-इमेजिंग, पीएच सेंसिंग, हाइड्रोजन पेरोक्साइड डिटेक्शन, क्रोमोफोर असिस्टेड लाइट इनएक्टिवेशन, और मल्टी-फोटॉन लाइट माइक्रोस्कोपी। हेलो-टैग के नाम से जाने जाने वाले बैक्टीरियल हेलोएल्केन डीहैलोजेनेज से प्राप्त एक मोनोमेरिक प्रोटीन के उपयोग के साथ पहली बार जीवित जानवरों में विवो इमेजिंग अध्ययन किया गया है। हेलो-टैग सहसंयोजक अपने लिगेंड से जुड़ता है और घुलनशील प्रोटीन की बेहतर अभिव्यक्ति की अनुमति देता है।

लाभ
हालांकि प्रतिदीप्त रंजक में रेडियोधर्मी जांच के समान संवेदनशीलता नहीं हो सकती है, लेकिन वे कार्रवाई में अणुओं की वास्तविक समय गतिविधि दिखाने में सक्षम हैं। इसके अलावा, विकिरण और उचित हैंडलिंग अब चिंता का विषय नहीं है।

फ्लोरोसेंट टैगिंग के विकास के साथ, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ने फिक्स्ड और लाइव सेल इमेज दोनों में विशिष्ट प्रोटीन के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी है। विशिष्ट प्रोटीनों के स्थानीयकरण ने कोशिकीय जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण अवधारणाओं को जन्म दिया है जैसे कि कोशिकीय झिल्लियों और ऑर्गेनेल में प्रोटीन के अलग-अलग समूहों के कार्य। लाइव सेल इमेजिंग में, फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की गतिविधियों और उनकी बातचीत की निगरानी करने में सक्षम बनाता है।

फ्लोरोसेंट टैग से जुड़े तरीकों में नवीनतम प्रगति ने विभिन्न जीवों के भीतर एमआरएनए और इसके स्थानीयकरण की कल्पना की है। आरएनए की लाइव सेल इमेजिंग को संश्लेषित आरएनए की शुरुआत करके प्राप्त किया जा सकता है जो रासायनिक रूप से माइक्रोइंजेक्शन द्वारा जीवित कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ युग्मित होता है। इस तकनीक का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया था कि कैसे ड्रोसोफिला भ्रूण में ऑस्कर एमआरएनए ओओसीट के पश्च (शरीर रचना) क्षेत्र में स्थानांतरित हो जाता है।

यह भी देखें

 * आणविक टैगिंग वेलोसिमेट्री
 * न्यूक्लिक एसिड मापन के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर
 * प्रोटीन टैग