पूरक डीएनए

आनुवंशिकी में, पूरक डीएनए (सीडीएनए) एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया में एकल-फंसे आरएनए (जैसे, मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) या माइक्रो RNA (एमआईआरएनए)) टेम्पलेट से डीएनए संश्लेषित होता है। cDNA का उपयोग अक्सर एक सेल में एक विशिष्ट प्रोटीन को जीन अभिव्यक्ति के लिए किया जाता है जो सामान्य रूप से उस प्रोटीन (यानी, विषम अभिव्यक्ति) को व्यक्त नहीं करता है, या डीएनए आधारित विधियों (qPCR, RNA-seq) का उपयोग करके mRNA अणुओं को अनुक्रमित या परिमाणित करता है। सीडीएनए जो एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए कोड अभिव्यक्ति के लिए प्राप्तकर्ता सेल में स्थानांतरित किया जा सकता है, अक्सर जीवाणु या खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली। सीडीएनए भी माइक्रोएरे, वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और RNA-Seq|RNA-seq जैसे परखों में थोक ऊतक, एकल कोशिकाओं, या एकल नाभिक में transcriptome  प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए उत्पन्न होता है।

cDNA भी स्वाभाविक रूप से रेट्रोवायरस (जैसे एचआईवी-1, एचआईवी-2, सिमियन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस, आदि) द्वारा निर्मित होता है और फिर मेजबान के जीनोम में एकीकृत होता है, जहां यह एक प्रोवाइरस  बनाता है। सीडीएनए शब्द का प्रयोग आम तौर पर एक एमआरएनए ट्रांस्क्रिप्ट के अनुक्रम को संदर्भित करने के लिए जैव सूचना विज्ञान के संदर्भ में भी किया जाता है, जिसे आरएनए बेस (जीसीएयू) के बजाय डीएनए बेस (डीऑक्सी-जीसीएटी) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

2013 में यूएस सुप्रीम कोर्ट ने घोषित किया कि सीडीएनए पेटेंट-योग्य है, जबकि स्वाभाविक रूप से होने वाले डीएनए के पृथक अनुक्रम नहीं हैं (देखें एसोसिएशन फॉर मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी वी। असंख्य जेनेटिक्स, इंक।)

संश्लेषण
आरएनए सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। सेलुलर जीवन में, सीडीएनए लक्ष्य जीनोमिक डीएनए में आरएनए के एकीकरण के लिए वायरस और रेट्रोट्रांसपोसन द्वारा उत्पन्न होता है। आणविक जीव विज्ञान में, जीनोमिक डीएनए, प्रोटीन और अन्य सेलुलर घटकों को हटा दिए जाने के बाद आरएनए को स्रोत सामग्री से शुद्ध किया जाता है। सीडीएनए को फिर कृत्रिम परिवेशीय  रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है।

आरएनए शुद्धि
आरएनए को मेजबान कोशिकाओं में जीनोमिक डीएनए से लिखित किया जाता है और पहले लिसिस कोशिकाओं द्वारा आरएनए निष्कर्षण किया जाता है, फिर आरएनए को व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों जैसे फिनोल-क्लोरोफॉर्म, सिलिका कॉलम और बीड-आधारित आरएनए निष्कर्षण विधियों का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है। निष्कर्षण के तरीके स्रोत सामग्री के आधार पर भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, पौधे के ऊतकों से आरएनए निकालने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जैसे कि पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी), फेनोलिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट और अन्य यौगिकों को हटाने के लिए जो अन्यथा आरएनए को अनुपयोगी बना देंगे। डीएनए और प्रोटीन को हटाने के लिए, डीएनज़ और प्रोटीनएज़ के जैसे एंजाइमों को गिरावट के लिए उपयोग किया जाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि गनीडिनियम आइसोथियोसाइनेट, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), फिनोल या क्लोरोफॉर्म जैसे कैओट्रोपिक एजेंटों के साथ आरएनएस को निष्क्रिय करके आरएनए अखंडता को बनाए रखा जाता है। कुल आरएनए को तब अन्य सेलुलर घटकों से अलग किया जाता है और शराब के साथ अवक्षेपित किया जाता है। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए सरल और तीव्र आरएनए निष्कर्षणों के लिए विभिन्न वाणिज्यिक किट मौजूद हैं। आकार या अद्वितीय आरएनए क्षेत्रों के आधार पर विशिष्ट उप-प्रकार के आरएनए को अलग करने के लिए अतिरिक्त बीड-आधारित विधियों का उपयोग किया जा सकता है।

प्रथम-किनारा संश्लेषण
एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम और शुद्ध आरएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करके, सीडीएनए का एक स्ट्रैंड तैयार किया जाता है (प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण)। मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से एम-एमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग आमतौर पर लंबे समय तक आरएनए के ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयुक्त राइबोन्यूक्लिएज एच गतिविधि में कमी के कारण किया जाता है। एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस से एएमवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग आरएनए टेम्पलेट्स के लिए मजबूत माध्यमिक संरचनाओं (यानी उच्च पिघलने वाले तापमान) के साथ भी किया जा सकता है। सीडीएनए आमतौर पर एमआरएनए से जीन एक्सप्रेशन एनालिसिस जैसे रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन | आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनए-सेक | आरएनए-सीक के लिए उत्पन्न होता है। एमआरएनए ऑलिगो-डी थाइमिन प्राइमरों का उपयोग करके चुनिंदा रूप से रिवर्स ट्रांसकोड किया गया है जो पॉलीएडेनाइलेशन के रिवर्स पूरक हैं। सभी एमआरएनए के 3' छोर पर पॉली-एडिनाइलेटेड टेल। ओलिगो-डीटी और यादृच्छिक हेक्सामेर प्राइमरों का एक अनुकूलित मिश्रण 5' या 3' पूर्वाग्रह को कम करते हुए पूर्ण लंबाई सीडीएनए प्राप्त करने का मौका बढ़ाता है। राइबोसोमल आरएनए भी कुछ गैर-कोडिंग आरएनए जैसे एमआरएनए और गैर-पॉली-एडिनिलेटेड ट्रांसक्रिप्ट दोनों को समृद्ध करने के लिए समाप्त हो सकता है।

द्वितीय-किनारा संश्लेषण
प्रथम-स्ट्रैंड सिंथेसिस, आरएनए-डीएनए हाइब्रिड का परिणाम, कई सेकंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस विधियों के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है या सीधे डाउनस्ट्रीम एसेज़ में संसाधित किया जा सकता है। हेयरपिन-प्राइमेड सिंथेसिस के रूप में जानी जाने वाली एक प्रारंभिक विधि प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए के 3' छोर पर प्राइम सेकेंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस पर हेयरपिन के गठन पर निर्भर करती है। हालाँकि, भड़काना यादृच्छिक है और हेयरपिन हाइड्रोलिसिस से जानकारी का नुकसान होता है। Gubler और हॉफमैन प्रक्रिया E. Coli RNase H का उपयोग mRNA को निकने के लिए करती है जिसे E. Coli DNA पोलीमरेज़ I I से बदल दिया जाता है और E. Coli DNA ligase के साथ सील कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया का एक अनुकूलन M-MLV की निम्न RNase H गतिविधि पर निर्भर करता है ताकि शेष RNA के साथ निक mRNA को बाद में दूसरी-स्ट्रैंड cDNA के डीएनए पोलीमरेज़ अनुवाद के बाद RNase H जोड़कर हटा दिया जाए। यह mRNA के 5' छोर पर खोई हुई अनुक्रम सूचना को रोकता है।

अनुप्रयोग
पूरक डीएनए का उपयोग अक्सर क्लोन (आनुवांशिकी) या जीन जांच के रूप में या सीडीएनए पुस्तकालय के निर्माण में किया जाता है। जब वैज्ञानिक प्राप्तकर्ता सेल में प्रोटीन के रूप में नई आनुवंशिक सामग्री को व्यक्त करने के लिए एक जीन को एक सेल से दूसरे सेल में स्थानांतरित करते हैं, तो सीडीएनए को प्राप्तकर्ता (संपूर्ण जीन के बजाय) में जोड़ा जाएगा, क्योंकि पूरे जीन के लिए डीएनए डीएनए शामिल हो सकता है जो प्रोटीन के लिए कोड नहीं करता है या जो प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम को बाधित करता है (जैसे, इंट्रॉन)। सीडीएनए के आंशिक अनुक्रम अक्सर अभिव्यक्त अनुक्रम टैग के रूप में प्राप्त किए जाते हैं।

पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया (पीसीआर) के माध्यम से डीएनए अनुक्रमों के प्रवर्धन के साथ, अब आम तौर पर प्रारंभिक चरण के रूप में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का संचालन किया जाएगा, इसके बाद पीसीआर द्वारा इंट्रा-सेलुलर अभिव्यक्ति के लिए सीडीएनए का सटीक अनुक्रम प्राप्त किया जाएगा। यह अनुक्रम-विशिष्ट डीएनए प्राइमरों को डिज़ाइन करके प्राप्त किया जाता है जो प्रोटीन के लिए कोडिंग सीडीएनए क्षेत्र के 5' और 3' सिरों को संकरणित करता है। एक बार प्रवर्धित करने के बाद, अनुक्रम प्रत्येक छोर पर न्यूक्लियस के साथ काटा जा सकता है और अभिव्यक्ति वैक्टर के रूप में जाने वाले कई छोटे परिपत्र डीएनए अनुक्रमों में से एक में डाला जा सकता है। इस तरह के वैक्टर कोशिकाओं के अंदर स्व-प्रतिकृति और मेजबान डीएनए में संभावित एकीकरण की अनुमति देते हैं। वे आम तौर पर लक्ष्य सीडीएनए के ट्रांसक्रिप्शन को एमआरएनए में चलाने के लिए एक मजबूत प्रमोटर भी रखते हैं, जिसे बाद में प्रोटीन में अनुवादित किया जाता है।

cDNA का उपयोग RNA-seq या रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन | RT-qPCR जैसी विधियों के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है।  अनुक्रमण के लिए, अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म आकार सीमाओं के कारण RNA को खंडित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, सेकेंड-स्ट्रैंड सिंथेसाइज्ड सीडीएनए को एडेप्टर के साथ जोड़ा जाना चाहिए जो सीडीएनए के टुकड़ों को पीसीआर प्रवर्धित करने की अनुमति देता है और सीक्वेंसिंग फ्लो सेल से जुड़ता है। जीन-विशिष्ट विश्लेषण विधियां आमतौर पर फ्लोरोमेट्रिक और अन्य विधियों के माध्यम से सीडीएनए स्तरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइक्रोएरे और आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करती हैं।

13 जून 2013 को, संयुक्त राज्य अमेरिका के सुप्रीम कोर्ट ने एसोसिएशन फॉर मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी बनाम असंख्य जेनेटिक्स के मामले में फैसला सुनाया कि जबकि स्वाभाविक रूप से होने वाले जीन का पेटेंट नहीं कराया जा सकता है, सीडीएनए पेटेंट-योग्य है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से नहीं होता है।

वायरस और रेट्रोट्रांसपोसन्स
कुछ वायरस अपने वायरल आरएनए को एमआरएनए (वायरल आरएनए → सीडीएनए → एमआरएनए) में बदलने के लिए सीडीएनए का भी उपयोग करते हैं। वायरल प्रोटीन को होस्ट सेल पर कब्जा करने के लिए एमआरएनए का उपयोग किया जाता है।

वायरल आरएनए से सीडीएनए तक के इस पहले चरण का एक उदाहरण संक्रमण के एचआईवी चक्र में देखा जा सकता है। यहां, मेजबान कोशिका झिल्ली वायरस के लिपिड लिफाफे से जुड़ी होती है जो वायरल कैप्सिड को वायरल जीनोम आरएनए की दो प्रतियों के साथ मेजबान में प्रवेश करने की अनुमति देती है। फिर सीडीएनए की प्रतिलिपि वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से बनाई जाती है, एक प्रक्रिया जिसे चैपरोन एसवाईपीए और एक वायरल कैप्सिड संबंधित रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा सुगम बनाया जाता है। सीडीएनए यूकेरियोटिक जीनोम में रेट्रोट्रांसपोसन द्वारा भी उत्पन्न होता है। रेट्रोट्रांस्पॉन्स मोबाइल जेनेटिक तत्व हैं जो खुद को आरएनए इंटरमीडिएट के माध्यम से जीनोम के भीतर और कभी-कभी बीच में ले जाते हैं। यह तंत्र संक्रामक कणों की उत्पत्ति के बहिष्करण के साथ वायरस के साथ साझा किया जाता है।

यह भी देखें

 * (आरटी-क्यूपीसीआर)
 * (आरटी-क्यूपीसीआर)
 * (आरटी-क्यूपीसीआर)
 * (आरटी-क्यूपीसीआर)

संदर्भ
Mark D. Adams et al. “Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project.” Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.

Philip M. Murphy, and H. Lee Tiffany. “Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor.” Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.

बाहरी संबंध

 * H-Invitational Database
 * Functional Annotation of the Mouse database
 * Complementary DNA tool


 * http://news.icecric.com/today-match-prediction/