उच्च उत्पादन द्रव क्रोमैटोग्राफी

उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), जिसे पहले उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी कहा जाता था, विश्लेषणात्मक रसायन शास्त्र में एक तकनीक है जो मिश्रण में प्रत्येक घटक को अलग करने, पहचानने और मापने के लिए उपयोग की जाती है। यह एक ठोस सोखना से भरे कॉलम के माध्यम से नमूना मिश्रण युक्त एक दबाव वाले तरल विलायक को पारित करने के लिए पंपों पर निर्भर करता है। नमूने में प्रत्येक घटक adsorbent सामग्री के साथ थोड़ा अलग तरीके से बातचीत करता है, जिससे विभिन्न घटकों के लिए अलग-अलग प्रवाह दर होती है और घटकों को अलग करने के लिए अग्रणी होता है क्योंकि वे स्तंभ से बाहर निकलते हैं।

एचपीएलसी का उपयोग निर्माण के लिए किया गया है (जैसे, दवा और जैविक उत्पादों की उत्पादन प्रक्रिया के दौरान), कानूनी (जैसे, मूत्र में प्रदर्शन बढ़ाने वाली दवाओं का पता लगाने), अनुसंधान (जैसे, अलग करना) एक जटिल जैविक नमूने के घटक, या एक दूसरे से समान सिंथेटिक रसायनों के), और चिकित्सा (जैसे, रक्त सीरम में विटामिन डी के स्तर का पता लगाना) उद्देश्य। क्रोमैटोग्राफी को बड़े पैमाने पर स्थानांतरण प्रक्रिया के रूप में वर्णित किया जा सकता है जिसमें सोखना शामिल है। एचपीएलसी एक दबावयुक्त तरल और एक नमूना मिश्रण को adsorbent से भरे एक कॉलम के माध्यम से पारित करने के लिए पंपों पर निर्भर करता है, जिससे नमूना घटकों को अलग किया जा सकता है। स्तंभ का सक्रिय घटक, अधिशोषक, आमतौर पर ठोस कणों (जैसे, सिलिका, पॉलिमर, आदि) से बना एक दानेदार पदार्थ होता है, जिसका आकार 2-50 माइक्रोन होता है। नमूना मिश्रण के घटक adsorbent कणों के साथ उनकी अलग-अलग डिग्री की बातचीत के कारण एक दूसरे से अलग हो जाते हैं। दबावयुक्त तरल आमतौर पर सॉल्वैंट्स (जैसे, पानी, एसीटोनिट्राइल और/या मेथनॉल) का मिश्रण होता है और इसे मोबाइल चरण के रूप में संदर्भित किया जाता है। इसकी संरचना और तापमान नमूना घटकों और adsorbent के बीच होने वाली बातचीत को प्रभावित करके पृथक्करण प्रक्रिया में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। ये अन्योन्य क्रियाएँ प्रकृति में भौतिक होती हैं, जैसे हाइड्रोफोबिक (फैलाने वाला), द्विध्रुव-द्विध्रुवीय और आयनिक, अक्सर एक संयोजन।

एचपीएलसी पारंपरिक (कम दबाव) क्रोमैटोग्राफी # तरल क्रोमैटोग्राफी से अलग है क्योंकि परिचालन दबाव काफी अधिक (50-350 बार) है, जबकि साधारण तरल क्रोमैटोग्राफी आमतौर पर कॉलम के माध्यम से मोबाइल चरण को पारित करने के लिए गुरुत्वाकर्षण बल पर निर्भर करती है। विश्लेषणात्मक एचपीएलसी में अलग की गई छोटी नमूना राशि के कारण, विशिष्ट स्तंभ आयाम 2.1–4.6 मिमी व्यास और 30–250 मिमी लंबाई हैं। साथ ही एचपीएलसी कॉलम छोटे अधिशोषक कणों (औसत कण आकार में 2-50 माइक्रोमीटर) से बने होते हैं। यह मिश्रण को अलग करते समय एचपीएलसी को बेहतर संकल्प शक्ति (यौगिकों के बीच अंतर करने की क्षमता) देता है, जो इसे एक लोकप्रिय क्रोमैटोग्राफिक तकनीक बनाता है।

एचपीएलसी उपकरण के योजनाबद्ध में आम तौर पर एक degasser, नमूना, पंप और एक डिटेक्टर शामिल होता है। सैंपलर नमूना मिश्रण को मोबाइल फेज स्ट्रीम में लाता है जो इसे कॉलम में ले जाता है। पंप कॉलम के माध्यम से मोबाइल चरण की वांछित प्रवाह और संरचना प्रदान करते हैं। डिटेक्टर स्तंभ से निकलने वाले नमूना घटक की मात्रा के अनुपात में एक संकेत उत्पन्न करता है, इसलिए नमूना घटकों के मात्रा विश्लेषण की अनुमति देता है। एक डिजिटल माइक्रोप्रोसेसर और उपयोगकर्ता सॉफ्टवेयर एचपीएलसी उपकरण को नियंत्रित करते हैं और डेटा विश्लेषण प्रदान करते हैं। एचपीएलसी उपकरण में यांत्रिक पंपों के कुछ मॉडल समय के साथ बदलते अनुपात में कई सॉल्वैंट्स को एक साथ मिला सकते हैं, जिससे मोबाइल चरण में एक संरचना ढाल उत्पन्न होती है। विभिन्न डिटेक्टर सामान्य उपयोग में हैं, जैसे यूवी/विज़, photodiode  सरणी (पीडीए) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित। अधिकांश एचपीएलसी उपकरणों में एक स्तंभ ओवन भी होता है जो उस तापमान को समायोजित करने की अनुमति देता है जिस पर पृथक्करण किया जाता है।

ऑपरेशन
अलग किए जाने वाले और विश्लेषण किए जाने वाले नमूना मिश्रण को असतत छोटी मात्रा (आमतौर पर माइक्रोलिटर) में कॉलम के माध्यम से मोबाइल चरण की धारा में पेश किया जाता है। नमूने के घटक विभिन्न वेगों पर स्तंभ के माध्यम से चलते हैं, जो adsorbent (जिसे स्थिर चरण भी कहा जाता है) के साथ विशिष्ट भौतिक अंतःक्रियाओं का एक कार्य है। प्रत्येक घटक का वेग उसकी रासायनिक प्रकृति, स्थिर चरण (स्तंभ) की प्रकृति और मोबाइल चरण की संरचना पर निर्भर करता है। वह समय जिस पर एक विशिष्ट विश्लेषण elutes (कॉलम से उभरता है) को इसका प्रतिधारण समय कहा जाता है। विशेष परिस्थितियों में मापा गया अवधारण समय किसी दिए गए विश्लेषण की एक पहचान विशेषता है।

कई अलग-अलग प्रकार के स्तंभ उपलब्ध हैं, जो कण आकार, सरंध्रता और सतह रसायन विज्ञान में भिन्न-भिन्न अवशोषक से भरे हुए हैं। छोटे कण आकार की पैकिंग सामग्री के उपयोग के लिए उच्च परिचालन दबाव (बैकप्रेशर) के उपयोग की आवश्यकता होती है और आमतौर पर क्रोमैटोग्राफिक रिज़ॉल्यूशन (क्रोमैटोग्राफी) (कॉलम से निकलने वाले लगातार एनालिटिक्स के बीच चरम पृथक्करण की डिग्री) में सुधार होता है। सॉर्बेंट कण प्रकृति में हाइड्रोफोबिक या ध्रुवीय हो सकते हैं।

उपयोग किए जाने वाले सामान्य मोबाइल चरणों में विभिन्न कार्बनिक सॉल्वैंट्स (सबसे आम acetonitrile और मेथनॉल हैं) के साथ पानी (अणु) का कोई भी गलत संयोजन शामिल है। कुछ एचपीएलसी तकनीकें जल-मुक्त मोबाइल चरणों का उपयोग करती हैं (नीचे #सामान्य-चरण क्रोमैटोग्राफी देखें। सामान्य-चरण क्रोमैटोग्राफी देखें)। मोबाइल चरण के जलीय घटक में नमूना घटकों को अलग करने में सहायता के लिए एसिड (जैसे फॉर्मिक, फॉस्फोरिक या ट्री फ्लुओरो असेटिक अमल) या लवण हो सकते हैं। क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण के दौरान मोबाइल चरण की संरचना को स्थिर (आइसोक्रेटिक एल्यूशन मोड) या विविध (ग्रेडिएंट एल्यूशन मोड) रखा जा सकता है। आइसोक्रेटिक रेफरेंस आमतौर पर नमूना घटकों के पृथक्करण में प्रभावी होता है जो स्थिर चरण के लिए उनकी आत्मीयता में बहुत भिन्न होते हैं। ढाल क्षालन में मोबाइल चरण की संरचना आमतौर पर निम्न से उच्च निक्षालन शक्ति में भिन्न होती है। तेजी से रेफरेंस (= कम अवधारण समय) पैदा करने वाली उच्च एल्यूटिंग ताकत के साथ मोबाइल फेज की एल्यूटिंग स्ट्रेंथ एनालिट रिटेंशन टाइम से परिलक्षित होती है। उल्टे चरण क्रोमैटोग्राफी में एक विशिष्ट ढाल प्रोफ़ाइल 5% एसीटोनिट्राइल (पानी या जलीय बफर में) से शुरू हो सकती है और 5-25 मिनट में 95% एसीटोनिट्राइल तक रैखिक रूप से प्रगति कर सकती है। निरंतर मोबाइल चरण संरचना की अवधि किसी भी ढाल प्रोफ़ाइल का हिस्सा हो सकती है। उदाहरण के लिए, मोबाइल चरण संरचना को 1-3 मिनट के लिए 5% एसीटोनिट्राइल पर स्थिर रखा जा सकता है, इसके बाद 95% एसीटोनिट्राइल तक रैखिक परिवर्तन किया जा सकता है। मोबाइल चरण की चुनी हुई संरचना विभिन्न नमूना घटकों (एनालिटिक्स) और स्थिर चरण (उदाहरण के लिए, उलट-चरण एचपीएलसी में हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन) के बीच बातचीत की तीव्रता पर निर्भर करती है। स्थिर और मोबाइल चरणों के लिए उनकी आत्मीयता के आधार पर, कॉलम में होने वाली पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान दोनों के बीच विभाजन का विश्लेषण करता है। यह विभाजन प्रक्रिया उसी के समान है जो एक तरल-तरल निष्कर्षण के दौरान होती है लेकिन निरंतर होती है, चरणबद्ध नहीं। इस उदाहरण में, एक पानी/एसीटोनिट्राइल ग्रेडिएंट का उपयोग करते हुए, अधिक हाइड्रोफोबिक घटक क्षालन (कॉलम से बाहर आना) देर से आएंगे, एक बार मोबाइल चरण एसीटोनिट्रिल में अधिक केंद्रित हो जाता है (यानी, उच्च एल्यूटिंग ताकत के मोबाइल चरण में)।

मोबाइल चरण घटकों, योजक (जैसे लवण या एसिड) और ढाल की स्थिति का विकल्प स्तंभ और नमूना घटकों की प्रकृति पर निर्भर करता है। एचपीएलसी विधि खोजने के लिए अक्सर परीक्षण की एक श्रृंखला नमूने के साथ की जाती है जो पर्याप्त पृथक्करण देती है।

इतिहास और विकास
एचपीएलसी से पहले वैज्ञानिक मानक तरल क्रोमैटोग्राफिक तकनीकों का इस्तेमाल करते थे। विलायक की प्रवाह दर गुरुत्वाकर्षण पर निर्भर होने के कारण तरल क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम काफी हद तक अक्षम थे। अलगाव को पूरा होने में कई घंटे और कभी-कभी दिन लग जाते थे। उस समय गैस वर्णलेखन  (जीसी) तरल क्रोमाटोग्राफी (एलसी) से अधिक शक्तिशाली थी, हालांकि, यह माना जाता था कि गैस चरण पृथक्करण और बहुत ध्रुवीय उच्च आणविक भार बायोपॉलिमरों का विश्लेषण असंभव था। विलेय की तापीय अस्थिरता के कारण जीसी कई जैव रसायनविदों के लिए अप्रभावी था। नतीजतन, वैकल्पिक तरीकों की परिकल्पना की गई थी जिसके परिणामस्वरूप जल्द ही एचपीएलसी का विकास होगा।

1941 में मार्टिन और सिंज के मौलिक कार्य के बाद, 1960 के दशक में जे. केल्विन गिडिंग्स, जोसेफ ह्यूबर और अन्य लोगों द्वारा भविष्यवाणी की गई थी कि एलसी को पैकिंग-कण व्यास को काफी कम करके उच्च दक्षता मोड में संचालित किया जा सकता है। ठेठ एलसी (और जीसी) 150 माइक्रोन का स्तर और मोबाइल चरण वेग को बढ़ाने के लिए दबाव का उपयोग करना। इन भविष्यवाणियों ने 60 के दशक में 70 के दशक में व्यापक प्रयोग और शोधन किया। प्रारंभिक विकास अनुसंधान ने एलसी कणों में सुधार करना शुरू किया, और जिपैक्स का आविष्कार, एक सतही झरझरा कण, एचपीएलसी प्रौद्योगिकी के लिए आशाजनक था। 1970 के दशक में हार्डवेयर और इंस्ट्रूमेंटेशन में कई विकास हुए। शोधकर्ताओं ने एचपीएलसी प्रणाली का प्राथमिक डिजाइन बनाने के लिए पंप और इंजेक्टर का उपयोग करना शुरू किया। गैस एम्पलीफायर पंप आदर्श थे क्योंकि वे निरंतर दबाव में काम करते थे और स्थिर प्रवाह और अच्छी मात्रा के लिए रिसाव-मुक्त सील या चेक वाल्व की आवश्यकता नहीं होती थी। ड्यूपॉन्ट आईपीडी (औद्योगिक पॉलिमर डिवीजन) में हार्डवेयर मील के पत्थर बनाए गए थे जैसे कि एक कम-निवास-वॉल्यूम ग्रेडिएंट डिवाइस का उपयोग किया जा रहा है और साथ ही सेप्टम इंजेक्टर को लूप इंजेक्शन वाल्व के साथ बदल दिया गया है।

जबकि उपकरण संबंधी विकास महत्वपूर्ण थे, एचपीएलसी का इतिहास मुख्य रूप से कण प्रौद्योगिकी के इतिहास और विकास के बारे में है। झरझरा परत कणों की शुरुआत के बाद, दक्षता में सुधार के लिए कण आकार को कम करने की एक स्थिर प्रवृत्ति रही है। हालाँकि, कण आकार में कमी से नई समस्याएँ उत्पन्न हुईं। व्यावहारिक नुकसान कॉलम के माध्यम से मोबाइल तरल पदार्थ को मजबूर करने के लिए आवश्यक अत्यधिक दबाव ड्रॉप और बेहद अच्छी सामग्री की एक समान पैकिंग तैयार करने में कठिनाई से उत्पन्न होता है। हर बार कण का आकार काफी कम हो जाता है, दबाव को संभालने के लिए उपकरण विकास का एक और दौर आमतौर पर होना चाहिए।

विभाजन क्रोमैटोग्राफी
विभाजन क्रोमैटोग्राफी पहले प्रकार की क्रोमैटोग्राफी में से एक थी जिसे रसायनज्ञों ने विकसित किया था। विभाजन गुणांक सिद्धांत कागज क्रोमैटोग्राफी, पतली [[पेपर क्रोमैटोग्राफी]], गैस चरण और प्रतिधारा क्रोमैटोग्राफी | तरल-तरल पृथक्करण अनुप्रयोगों में लागू किया गया है। रसायन विज्ञान में 1952 का नोबेल पुरस्कार आर्चर जॉन पोर्टर मार्टिन और रिचर्ड लॉरेंस मिलिंगटन सिन्ज द्वारा तकनीक के विकास के लिए अर्जित किया गया था, जिसका उपयोग अमीनो अम्ल को अलग करने के लिए किया गया था। विभाजन क्रोमैटोग्राफी सतह पर या कागज क्रोमैटोग्राफी के साथ एक अक्रिय ठोस सहायक मैट्रिक्स के अनाज या तंतुओं के भीतर एक बनाए रखा विलायक का उपयोग करता है; या स्थिर चरण के साथ कुछ कूलम्बिक और/या हाइड्रोजन दाता  इंटरैक्शन का लाभ उठाता है। एक तरल स्थिर चरण और एलुएंट के बीच अणुओं के विभाजन का विश्लेषण करें। HILIC (HILIC; HPLC के भीतर एक उप-तकनीक) की तरह, यह विधि विश्लेषणों को उनके ध्रुवीयता में अंतर के आधार पर अलग करती है। HILIC अक्सर एक बंधुआ ध्रुवीय स्थिर चरण (रसायन विज्ञान) और एक मोबाइल चरण का उपयोग करता है जो मुख्य रूप से एसिटोनिट्राइल से बना होता है जिसमें पानी मजबूत घटक के रूप में होता है। विभाजन एचपीएलसी का उपयोग ऐतिहासिक रूप से अबंधित सिलिका या एल्यूमिना समर्थन पर किया गया है। सापेक्ष ध्रुवीय अंतरों द्वारा विश्लेषणों को अलग करने के लिए प्रत्येक प्रभावी ढंग से काम करता है। HILIC बंधित चरणों में एकल क्रोमैटोग्राफिक रन में अम्लीय, क्षार (रसायन विज्ञान) और तटस्थ विलेय को अलग करने का लाभ है। ध्रुवीय विश्लेषण ध्रुवीय स्थिर चरण से जुड़ी एक स्थिर जल परत में फैल जाते हैं और इस प्रकार बने रहते हैं। ध्रुवीय विश्लेषण और ध्रुवीय स्थिर चरण (मोबाइल चरण के सापेक्ष) के बीच परस्पर क्रिया जितनी मजबूत होती है, उतना ही लंबा रेफरेंस टाइम। अधिक ध्रुवीकृत समूहों (जैसे, हाइड्रॉक्सिल-) और अधिक प्रतिधारण को प्रेरित करने वाले हाइड्रोजन बंधन में सक्षम समूहों के साथ, बातचीत की ताकत विश्लेषण आणविक संरचना के कार्यात्मक समूहों के हिस्से पर निर्भर करती है। कूलम्बिक (इलेक्ट्रोस्टैटिक) इंटरैक्शन भी प्रतिधारण बढ़ा सकते हैं। मोबाइल चरण में अधिक ध्रुवीय सॉल्वैंट्स का उपयोग एनालिटिक्स के अवधारण समय को कम करेगा, जबकि अधिक हाइड्रोफोबिक सॉल्वैंट्स अवधारण समय को बढ़ाते हैं।

सामान्य-चरण क्रोमैटोग्राफी
सामान्य-चरण क्रोमैटोग्राफी एचपीएलसी के पहले प्रकारों में से एक थी जिसे रसायनज्ञों ने विकसित किया था। सामान्य-चरण एचपीएलसी (एनपी-एचपीएलसी) के रूप में भी जाना जाता है, यह विधि सिलिका जैसी ध्रुवीय स्थिर सतह के लिए उनकी आत्मीयता के आधार पर विश्लेषणों को अलग करती है, इसलिए यह ध्रुवीय अंतःक्रियाओं (जैसे हाइड्रोजन बंध  या द्विध्रुवीय-) में संलग्न होने की विश्लेषण क्षमता पर आधारित है। द्विध्रुवीय प्रकार की बातचीत) सॉर्बेंट सतह के साथ। एनपी-एचपीएलसी एक गैर-ध्रुवीय, गैर-जलीय मोबाइल चरण (जैसे,  क्लोरोफार्म ) का उपयोग करता है, और गैर-ध्रुवीय सॉल्वैंट्स में आसानी से घुलनशील विश्लेषणों को अलग करने के लिए प्रभावी ढंग से काम करता है। विश्लेषण ध्रुवीय स्थिर चरण के साथ जुड़ता है और इसे बनाए रखता है। बढ़ी हुई विश्लेषण ध्रुवीयता के साथ सोखने की ताकत बढ़ जाती है। अंतःक्रियात्मक शक्ति न केवल विश्लेषण अणु की संरचना में मौजूद कार्यात्मक समूहों पर निर्भर करती है, बल्कि स्टेरिक प्रभावों पर भी निर्भर करती है। अंतःक्रिया शक्ति पर स्टेरिक बाधा का प्रभाव इस विधि को संरचनात्मक आइसोमर्स (अलग) को हल करने की अनुमति देता है।

मोबाइल चरण में अधिक ध्रुवीय सॉल्वैंट्स के उपयोग से एनालिटिक्स के अवधारण समय में कमी आएगी, जबकि अधिक हाइड्रोफोबिक सॉल्वैंट्स धीमे रेफरेंस (प्रतिधारण समय में वृद्धि) को प्रेरित करते हैं। मोबाइल चरण में पानी के निशान जैसे बहुत ध्रुवीय सॉल्वैंट्स स्थिर चरण की ठोस सतह को एक स्थिर बाध्य (पानी) परत बनाने के लिए adsorb करते हैं जिसे प्रतिधारण में सक्रिय भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। यह व्यवहार सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी के लिए कुछ हद तक अजीब है क्योंकि यह लगभग विशेष रूप से एक सोखना तंत्र द्वारा नियंत्रित होता है (यानी, एनालिटिक्स सॉर्बेंट सतह से जुड़ी एक लिगैंड की सॉल्वेटेड परत के बजाय एक ठोस सतह के साथ बातचीत करते हैं; नीचे उलट-चरण एचपीएलसी भी देखें। ). सोखना क्रोमैटोग्राफी अभी भी सक्रिय (सूखे) सिलिका या अल्युमिना  समर्थन पर स्तंभ और पतली परत क्रोमैटोग्राफी दोनों स्वरूपों में संरचनात्मक आइसोमर अलगाव के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाती है।

विभाजन- और एनपी-एचपीएलसी 1970 के दशक में उल्टे-चरण क्रोमैटोग्राफी के विकास के पक्ष से बाहर हो गए। उलट-चरण एचपीएलसी की सतह पर पानी या प्रोटिक कार्बनिक विलायक परत की उपस्थिति के कारण प्रतिधारण समय की खराब प्रजनन क्षमता के कारण सिलिका या एल्यूमिना क्रोमैटोग्राफिक मीडिया। यह परत मोबाइल चरण (जैसे, नमी के स्तर) की संरचना में किसी भी बदलाव के साथ बदल जाती है, जिससे ड्रिफ्टिंग अवधारण समय होता है।

हाल ही में, हिलिक बंधुआ चरणों के विकास के साथ विभाजन क्रोमैटोग्राफी फिर से लोकप्रिय हो गई है, जो बेहतर पुनरुत्पादन प्रदर्शित करती है, और तकनीक की उपयोगिता की सीमा की बेहतर समझ के कारण।

विस्थापन क्रोमैटोग्राफी
विस्थापन क्रोमैटोग्राफी का मूल सिद्धांत है: क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स (विस्थापक) के लिए एक उच्च आत्मीयता वाला एक अणु बाध्यकारी साइटों के लिए प्रभावी रूप से प्रतिस्पर्धा करेगा, और इस प्रकार सभी अणुओं को कम समानता के साथ विस्थापित करेगा। विस्थापन और क्षालन क्रोमैटोग्राफी के बीच स्पष्ट अंतर हैं। रेफरेंस मोड में, पदार्थ आमतौर पर संकीर्ण, गॉसियन चोटियों में एक स्तंभ से निकलते हैं। अधिकतम शुद्धि प्राप्त करने के लिए चोटियों का व्यापक पृथक्करण, अधिमानतः आधार रेखा के लिए वांछित है। जिस गति से मिश्रण का कोई घटक रेफरेंस मोड में कॉलम के नीचे जाता है वह कई कारकों पर निर्भर करता है। लेकिन दो पदार्थों के लिए अलग-अलग गति से यात्रा करने के लिए, और इस तरह हल किया जाना चाहिए, जैव-अणुओं और क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स के बीच कुछ अंतःक्रियाओं में पर्याप्त अंतर होना चाहिए। इस अंतर के प्रभाव को अधिकतम करने के लिए ऑपरेटिंग पैरामीटर समायोजित किए जाते हैं। कई मामलों में, चोटियों का बेसलाइन पृथक्करण केवल ग्रेडिएंट रेफरेंस और लो कॉलम लोडिंग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, रेफरेंस मोड क्रोमैटोग्राफी में दो कमियां, विशेष रूप से प्रारंभिक पैमाने पर, कम कॉलम लोडिंग के कारण ग्रेडिएंट सॉल्वेंट पंपिंग और कम थ्रूपुट के कारण परिचालन जटिलता है। विस्थापन क्रोमैटोग्राफी में क्षालन क्रोमैटोग्राफी पर लाभ होता है जिसमें घटकों को "चोटियों" के बजाय शुद्ध पदार्थों के लगातार क्षेत्रों में हल किया जाता है। क्योंकि प्रक्रिया समताप रेखाओं की गैर-रैखिकता का लाभ उठाती है, एक बड़े स्तंभ फ़ीड को दिए गए स्तंभ पर अलग किया जा सकता है, जिसमें शुद्ध घटकों को काफी उच्च सांद्रता पर पुनर्प्राप्त किया जाता है।

उलटा-चरण क्रोमैटोग्राफी (आरपीसी)


उत्क्रमित चरण एचपीएलसी (आरपी-एचपीएलसी) में एक गैर-ध्रुवीय स्थिर चरण और एक जलीय, मध्यम ध्रुवीय मोबाइल चरण होता है। एक सामान्य स्थिर चरण एक सिलिका है जिसे आरएमई के साथ सतह-संशोधित किया गया है2SiCl, जहाँ R एक सीधी श्रृंखला वाला एल्काइल समूह है जैसे C18H37 या सी8H17. ऐसे स्थिर चरणों के साथ, अणुओं के लिए अवधारण समय अधिक होता है जो कम ध्रुवीय होते हैं, जबकि ध्रुवीय अणु अधिक आसानी से (विश्लेषण में प्रारंभिक) होते हैं। एक विश्लेषक मोबाइल चरण में अधिक पानी जोड़कर प्रतिधारण समय बढ़ा सकता है; जिससे हाइड्रोफोबिक स्थिर चरण के लिए हाइड्रोफोबिक विश्लेषण की आत्मीयता अब और अधिक हाइड्रोफिलिक मोबाइल चरण के सापेक्ष मजबूत हो जाती है। इसी तरह, एक अन्वेषक निक्षालन में अधिक कार्बनिक विलायक जोड़कर अवधारण समय को कम कर सकता है। आरपी-एचपीएलसी का इतना सामान्य रूप से उपयोग किया जाता है कि इसे बिना किसी और विनिर्देश के अक्सर गलत तरीके से एचपीएलसी के रूप में संदर्भित किया जाता है। फार्मास्युटिकल उद्योग नियमित रूप से आरपी-एचपीएलसी को उनकी रिहाई से पहले योग्य बनाने के लिए नियोजित करता है।

आरपी-एचपीएलसी हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के सिद्धांत पर काम करता है, जो द्विध्रुवी जल संरचना में उच्च समरूपता से उत्पन्न होता है और जीवन विज्ञान में सभी प्रक्रियाओं में सबसे महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आरपी-एचपीएलसी इन इंटरैक्टिव बलों की माप की अनुमति देता है। स्थिर चरण के लिए विश्लेषण का बंधन स्थिर चरण पर लिगैंड के सहयोग से विश्लेषण अणु के गैर-ध्रुवीय खंड के आसपास संपर्क सतह क्षेत्र के समानुपाती होता है। विश्लेषण और सी के आसपास गुहा-कमी के लिए पानी के बल पर इस सॉल्वोफोबिक प्रभाव का प्रभुत्व है18-चैन बनाम दोनों का परिसर। इस प्रक्रिया में जारी ऊर्जा निक्षालन (जल: 7.3.3) के पृष्ठ तनाव के समानुपाती होती है जूल/सेमी2, मेथनॉल: 2.2 जे/सेमी2) और क्रमशः विश्लेषण और लिगैंड की हाइड्रोफोबिक सतह पर। पानी की सतह के तनाव को कम करने के लिए मोबाइल चरण में कम ध्रुवीय विलायक (मेथनॉल, एसीटोनिट्रिल) जोड़कर अवधारण को कम किया जा सकता है। क्रमिक क्षालन विश्लेषण के दौरान जलीय मोबाइल चरण की ध्रुवता और सतह के तनाव को स्वचालित रूप से कम करके इस प्रभाव का उपयोग करता है।

विश्लेषण अणु के संरचनात्मक गुण इसकी प्रतिधारण विशेषताओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सामान्य तौर पर, एक बड़े हाइड्रोफोबिक सतह क्षेत्र (सी-एच, सी-सी, और आम तौर पर गैर-ध्रुवीय परमाणु बंधन, जैसे एसएस और अन्य) के साथ एक विश्लेषण लंबे समय तक बनाए रखा जाता है क्योंकि यह जल संरचना के साथ गैर-बातचीत कर रहा है। दूसरी ओर, उच्च ध्रुवीय सतह क्षेत्र के साथ विश्लेषण (ध्रुवीय समूहों की उपस्थिति द्वारा प्रदान किया गया, जैसे -ओएच, -एनएच2, सीओओ− या -NH3+ उनकी संरचना में) कम बनाए रखा जाता है क्योंकि वे पानी में बेहतर रूप से एकीकृत होते हैं। इस तरह की बातचीत स्टेरिक प्रभाव के अधीन होती है, जिसमें बहुत बड़े अणु केवल स्थिर चरण के छिद्रों तक ही सीमित हो सकते हैं, जहां सतह के लिगैंड्स (एल्काइल चेन) के साथ बातचीत होती है। इस तरह की सतह बाधा आम तौर पर कम अवधारण में परिणाम देती है।

हाइड्रोफोबिक (गैर-ध्रुवीय) सतह क्षेत्र के साथ अवधारण समय बढ़ता है। शाखित शृंखला यौगिक अपने संबंधित रेखीय समावयवों की तुलना में अधिक तेजी से निक्षालन करते हैं क्योंकि समग्र सतह क्षेत्र घट जाता है। इसी प्रकार सिंगल सी-सी बॉन्ड वाले कार्बनिक यौगिक सी = सी या सी-सी ट्रिपल बॉन्ड वाले लोगों की तुलना में बाद में एल्यूट होते हैं, क्योंकि डबल या ट्रिपल बॉन्ड सिंगल सी-सी बॉन्ड से छोटा होता है।

मोबाइल चरण सतह तनाव (एलुएंट संरचना में संगठनात्मक ताकत) के अलावा, अन्य मोबाइल चरण संशोधक विश्लेषण प्रतिधारण को प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अकार्बनिक लवणों के योग से जलीय विलयनों के पृष्ठ तनाव में मध्यम रेखीय वृद्धि होती है (ca. 1.5 जे/सेमी2 NaCl के लिए प्रति मोल, 2.5 जे/सेमी2 प्रति मोल (NH4)2इसलिए4), और क्योंकि विश्लेषण-विलायक इंटरफ़ेस की एन्ट्रॉपी को सतह के तनाव से नियंत्रित किया जाता है, लवण के अतिरिक्त प्रतिधारण समय में वृद्धि होती है। इस तकनीक का उपयोग हल्के पृथक्करण और प्रोटीन की रिकवरी और प्रोटीन विश्लेषण (हाइड्रोफोबिक इंटरेक्शन क्रोमैटोग्राफी, एचआईसी) में उनकी जैविक गतिविधि के संरक्षण के लिए किया जाता है।

एक अन्य महत्वपूर्ण कारक मोबाइल चरण पीएच है क्योंकि यह विश्लेषण के हाइड्रोफोबिक चरित्र को बदल सकता है। इस कारण से अधिकांश विधियाँ पीएच को नियंत्रित करने के लिए सोडियम फास्फेट  जैसे बफरिंग एजेंट का उपयोग करती हैं। बफ़र्स कई उद्देश्यों की पूर्ति करते हैं: पीएच का नियंत्रण, स्थिर चरण की सिलिका सतह पर आवेश को बेअसर करना और विश्लेषण चार्ज को बेअसर करने के लिए आयन युग्मन एजेंटों के रूप में कार्य करना। अमोनियम फॉर्मेट को आमतौर पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री में जोड़ा जाता है ताकि विश्लेषण-अमोनियम व्यसनों के गठन से कुछ विश्लेषणों का पता लगाया जा सके। एक वाष्पशील कार्बनिक अम्ल जैसे कि  एसीटिक अम्ल, या सबसे सामान्य रूप से  चींटी का तेजाब , को अक्सर मोबाइल चरण में जोड़ा जाता है यदि मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कॉलम एलुएंट का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। डिटेक्टर और सॉल्वेंट डिलीवरी सिस्टम में इसकी दृढ़ता के कारण मास स्पेक्ट्रोमेट्री अनुप्रयोगों में ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड का उपयोग अक्सर किया जाता है, लेकिन अन्य डिटेक्टरों का उपयोग करने वाले अनुप्रयोगों में कार्बोक्जिलिक एसिड जैसे एनालिटिक्स की अवधारण में सुधार करने में प्रभावी हो सकता है, क्योंकि यह एक काफी मजबूत कार्बनिक एसिड है। एसिड और बफ़र्स के प्रभाव अनुप्रयोग से भिन्न होते हैं लेकिन आम तौर पर क्रोमैटोग्राफिक रिज़ॉल्यूशन में सुधार करते हैं।

सामान्य सिलिका स्तंभों की तुलना में उल्टे चरण स्तंभों को नुकसान पहुंचाना काफी कठिन है; हालाँकि, कई उल्टे चरण स्तंभों में एल्काइल व्युत्पन्न सिलिका कण होते हैं और इन्हें कभी भी जलीय आधार (रसायन विज्ञान) के साथ उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि ये अंतर्निहित सिलिका कण को ​​​​नष्ट कर देंगे। उनका उपयोग जलीय एसिड के साथ किया जा सकता है, लेकिन स्तंभ को बहुत लंबे समय तक एसिड के संपर्क में नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह एचपीएलसी उपकरण के धातु भागों को खराब कर सकता है। आरपी-एचपीएलसी कॉलम को अवशिष्ट एसिड या बफर को हटाने के लिए उपयोग के बाद साफ विलायक के साथ फ्लश किया जाना चाहिए, और विलायक की उचित संरचना में संग्रहित किया जाना चाहिए। यदि पदार्थों को अलग करने की सर्वोत्तम संभव क्षमता को बनाए रखना है तो एचपीएलसी स्तंभों की धातु सामग्री को कम रखा जाना चाहिए। एक स्तंभ की धातु सामग्री के लिए एक अच्छा परीक्षण एक नमूना इंजेक्ट करना है जो 2,2'- और 4,4'-बिपिरिडीन का मिश्रण है। क्योंकि 2,2'-बिपी धातु को चीलेट कर सकता है, 2,2'-बिपी के लिए शिखर का आकार विकृत (पूंछ) होगा जब धातु आयन सिलिका की सतह पर मौजूद होते हैं।..

आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी
आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), जिसे जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी या जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के रूप में भी जाना जाता है, आणविक आकार (वास्तव में एक कण के स्टोक्स त्रिज्या द्वारा) के आधार पर कणों को अलग करता है। यह आम तौर पर एक कम रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटोग्राफी है और इस प्रकार इसे अक्सर शुद्धिकरण के अंतिम, पॉलिशिंग चरण के लिए आरक्षित किया जाता है। यह शुद्ध प्रोटीन की तृतीयक संरचना और चतुर्धातुक संरचना का निर्धारण करने के लिए भी उपयोगी है। एसईसी मुख्य रूप से प्रोटीन या पॉलिमर जैसे बड़े अणुओं के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। एसईसी इन छोटे अणुओं को एक कण के छिद्रों में फंसाकर काम करता है। बड़े अणु केवल छिद्रों से गुजरते हैं क्योंकि वे छिद्रों में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़े होते हैं। इसलिए बड़े अणु छोटे अणुओं की तुलना में तेजी से स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित होते हैं, अर्थात अणु जितना छोटा होता है, अवधारण समय उतना ही अधिक होता है।

पॉलीसेकेराइड के आणविक भार निर्धारण के लिए इस तकनीक का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। SEC आधिकारिक तकनीक है (यूरोपीय फार्माकोपिया द्वारा सुझाई गई) विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कम आणविक भार हेपरिन की आणविक भार तुलना के लिए।

आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी
अनियन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईसी) में, प्रतिधारण विलेय आयनों और आवेशित साइटों के बीच स्थिर चरण के बीच आकर्षण पर आधारित है। कॉलम पर आवेशित साइटों के समान आवेश वाले विलेय आयनों को बंधन से बाहर रखा जाता है, जबकि स्तंभ के आवेशित स्थलों के विपरीत आवेश वाले विलेय आयनों को स्तंभ पर बनाए रखा जाता है। विलेय आयन जो स्तंभ पर बने रहते हैं, उन्हें विलायक की स्थिति में परिवर्तन करके स्तंभ से अलग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, विलयन की नमक सांद्रता को बढ़ाकर, स्तंभ के तापमान को बढ़ाकर, विलायक के पीएच को बदलकर विलायक प्रणाली के आयन प्रभाव को बढ़ाया जा सकता है।, वगैरह।)।

आयन एक्सचेंजर्स के प्रकार में पॉलीस्टाइरीन रेजिन, सेलूलोज़ और dextran  आयन एक्सचेंजर्स (जैल), और नियंत्रित-ताकना ग्लास या झरझरा सिलिका शामिल हैं। पॉलीस्टीरिन रेजिन क्रॉस लिंकेज की अनुमति देता है जो श्रृंखला की स्थिरता को बढ़ाता है। उच्च क्रॉस लिंकेज स्वेरविंग को कम करता है, जो संतुलन समय को बढ़ाता है और अंततः चयनात्मकता में सुधार करता है। सेल्युलोज और डेक्सट्रान आयन एक्सचेंजर्स में बड़े छिद्र आकार और कम आवेश घनत्व होते हैं जो उन्हें प्रोटीन पृथक्करण के लिए उपयुक्त बनाते हैं।

सामान्य तौर पर, आयन एक्सचेंजर्स उच्च आवेश और छोटे त्रिज्या वाले आयनों के बंधन का समर्थन करते हैं।

काउंटर आयन में वृद्धि (रेजिन में कार्यात्मक समूहों के संबंध में) एकाग्रता अवधारण समय को कम कर देती है। पीएच में कमी से धनायन विनिमय में अवधारण समय कम हो जाता है जबकि पीएच में वृद्धि ऋणायन विनिमय में अवधारण समय को कम कर देती है। उदाहरण के लिए, एक कटियन एक्सचेंज कॉलम में विलायक के पीएच को कम करके, अधिक हाइड्रोजन आयन आयनिक स्थिर चरण पर पदों के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए उपलब्ध होते हैं, जिससे कमजोर रूप से बंधे हुए धनायन समाप्त हो जाते हैं।

क्रोमैटोग्राफी के इस रूप का व्यापक रूप से निम्नलिखित अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है: जल शोधन, ट्रेस घटकों का पूर्व-संकेंद्रण, लिगैंड-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, प्रोटीन का आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, कार्बोहाइड्रेट और ऑलिगोसेकेराइड्स का उच्च-पीएच आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी, और अन्य।

बायोफिनिटी क्रोमैटोग्राफी
यह क्रोमैटोग्राफिक प्रक्रिया स्थिर, विशिष्ट और प्रतिवर्ती परिसरों को बनाने के लिए जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों की संपत्ति पर निर्भर करती है। इन परिसरों के निर्माण में सामान्य आणविक बलों जैसे वैन डेर वाल्स इंटरेक्शन, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन, डीपोल-डीपोल इंटरैक्शन, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन और हाइड्रोजन बॉन्ड की भागीदारी शामिल है। पूरक बाध्यकारी साइटों में इनमें से कई बलों की एक साथ और ठोस कार्रवाई से एक कुशल, जैव-विशिष्ट बंधन बनता है।

जलीय सामान्य-चरण क्रोमैटोग्राफी
जलीय सामान्य-चरण क्रोमैटोग्राफी (एएनपी) एक क्रोमैटोग्राफिक तकनीक है जो उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी (आरपी) और कार्बनिक सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी (ओएनपी) के बीच मोबाइल चरण क्षेत्र को शामिल करती है। इस तकनीक का उपयोग हाइड्रोफिलिक यौगिकों के लिए अद्वितीय चयनात्मकता प्राप्त करने के लिए किया जाता है, जो उलट-चरण सॉल्वैंट्स का उपयोग करके सामान्य चरण क्षालन दिखा रहा है।

ईसोक्रेटिक और ग्रेडिएंट रेफरेंस
एक अलगाव जिसमें मोबाइल चरण की संरचना पूरी प्रक्रिया के दौरान स्थिर रहती है, उसे आइसोक्रेटिक (अर्थात् निरंतर रचना) कहा जाता है। (इसका उदाहरण पूरी प्रक्रिया में मेथनॉल का प्रतिशत स्थिर रहेगा यानी 10%) यह शब्द Csaba Horváth (केमिकल इंजीनियर) द्वारा गढ़ा गया था जो HPLC के अग्रदूतों में से एक थे।,

मोबाइल चरण संरचना को स्थिर रहने की आवश्यकता नहीं है। एक पृथक्करण जिसमें पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान मोबाइल चरण की संरचना बदल जाती है, उसे ग्रेडिएंट रेफरेंस के रूप में वर्णित किया जाता है। एक उदाहरण एक ढाल है जो 10% मेथनॉल से शुरू होता है और 20 मिनट के बाद 90% मेथनॉल पर समाप्त होता है। मोबाइल चरण के दो घटकों को आम तौर पर ए और बी कहा जाता है; A कमजोर विलायक है जो विलेय को केवल धीरे-धीरे निक्षालित करने की अनुमति देता है, जबकि B प्रबल विलायक है जो तेजी से विलेय को स्तंभ से विलेय करता है। उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी में, विलायक ए अक्सर पानी या एक जलीय बफर होता है, जबकि बी एक कार्बनिक विलायक होता है जो पानी के साथ गलत होता है, जैसे कि एसिटोनिट्राइल, मेथनॉल, टेट्राहाइड्रोफ्यूरान या isopropanol

आइसोक्रेटिक रेफरेंस में, एन के लिए समीकरण, सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या के अनुसार अवधारण समय के साथ चोटी की चौड़ाई रैखिक रूप से बढ़ जाती है। इससे यह नुकसान होता है कि देर से निकलने वाली चोटियाँ बहुत सपाट और चौड़ी हो जाती हैं। उनका आकार और चौड़ाई उन्हें चोटियों के रूप में पहचाने जाने से रोक सकती है। ग्रैडिएंट एल्यूशन बाद के एल्यूटिंग घटकों की अवधारण को कम करता है जिससे कि वे तेजी से एल्यूट करते हैं, जिससे अधिकांश घटकों के लिए संकरा (और लंबा) शिखर होता है। यह पूंछ वाली चोटियों के लिए चोटी के आकार में भी सुधार करता है, क्योंकि कार्बनिक एलुएंट की बढ़ती एकाग्रता चोटी के पीछे वाले हिस्से को आगे बढ़ाती है। यह चोटी की ऊंचाई भी बढ़ाता है (शिखर तेज दिखता है), जो ट्रेस विश्लेषण में महत्वपूर्ण है। ढाल कार्यक्रम में कार्बनिक घटक के प्रतिशत में अचानक कदम वृद्धि, या अलग-अलग समय पर अलग-अलग ढलान शामिल हो सकते हैं - सभी न्यूनतम समय में इष्टतम पृथक्करण की इच्छा के अनुसार।

लोकतांत्रिक क्षालन में, यदि स्तंभ आयाम (लंबाई और आंतरिक व्यास) बदलते हैं, तो चयनात्मकता नहीं बदलती है - अर्थात, उसी क्रम में चोटियों का विस्तार होता है। ढाल क्षालन में, आयाम या प्रवाह दर परिवर्तन के रूप में क्षालन क्रम बदल सकता है।

उल्टे चरण क्रोमैटोग्राफी में प्रेरक शक्ति जल संरचना के उच्च क्रम में उत्पन्न होती है। मोबाइल चरण के कार्बनिक घटक की भूमिका इस उच्च क्रम को कम करना है और इस प्रकार जलीय घटक की मंदता शक्ति को कम करना है।

सैद्धांतिक
यूवी डिटेक्टर या मास स्पेक्ट्रोमीटर जैसे इंस्ट्रूमेंटेशन द्वारा पता लगाए जाने पर एचपीएलसी अलगाव में सैद्धांतिक पैरामीटर और समीकरण होते हैं जो सिग्नल चोटियों में घटकों को अलग करने का वर्णन करते हैं। पैरामीटर बड़े पैमाने पर क्रोमैटोग्राफिक सिद्धांत के दो सेटों से प्राप्त होते हैं: प्लेट सिद्धांत (विभाजन क्रोमैटोग्राफी के हिस्से के रूप में), और क्रोमैटोग्राफी / वैन डीमटर समीकरण की दर सिद्धांत। बेशक, उन्हें एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम के विश्लेषण के माध्यम से व्यवहार में लाया जा सकता है, हालांकि दर सिद्धांत को अधिक सटीक सिद्धांत माना जाता है।

वे एक पेपर क्रोमैटोग्राफी जुदाई के लिए प्रतिधारण कारक की गणना के अनुरूप हैं, लेकिन यह वर्णन करता है कि एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम पर चोटियों (बैंड) के रूप में पाए जाने वाले दो या दो से अधिक घटकों में मिश्रण को कितनी अच्छी तरह से अलग करता है। एचपीएलसी पैरामीटर हैं: दक्षता कारक (एन), अवधारण कारक (कप्पा प्राइम), और अलगाव कारक (अल्फा)। एक साथ कारक एक रिज़ॉल्यूशन समीकरण में चर होते हैं, जो बताता है कि दो घटकों की चोटियाँ एक-दूसरे से कितनी अच्छी तरह अलग या ओवरलैप होती हैं। ये पैरामीटर ज्यादातर केवल एचपीएलसी उलट चरण और एचपीएलसी सामान्य चरण अलगाव का वर्णन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं, क्योंकि ये अलगाव अन्य एचपीएलसी मोड (जैसे, आयन एक्सचेंज और आकार बहिष्करण) से अधिक सूक्ष्म होते हैं।

शून्य आयतन एक स्तंभ में स्थान की मात्रा है जो विलायक द्वारा कब्जा कर लिया गया है। यह कॉलम के भीतर का स्थान है जो कॉलम की आंतरिक पैकिंग सामग्री के बाहर है। शून्य मात्रा को क्रोमैटोग्राम पर मापा जाता है क्योंकि पहले घटक चोटी का पता चला है, जो आमतौर पर विलायक है जो नमूना मिश्रण में मौजूद था; आदर्श रूप से नमूना विलायक स्तंभ के साथ बातचीत किए बिना स्तंभ के माध्यम से बहता है, लेकिन एचपीएलसी विलायक से अलग के रूप में अभी भी पता लगाने योग्य है। शून्य मात्रा का उपयोग सुधार कारक के रूप में किया जाता है।

दक्षता कारक (एन) व्यावहारिक रूप से मापता है कि क्रोमैटोग्राम पर कितनी तेज घटक चोटियां हैं, घटक चोटी के क्षेत्र (प्रतिधारण समय) के अनुपात के रूप में चोटियों की चौड़ाई उनके व्यापक बिंदु (बेसलाइन पर) के सापेक्ष है। ऊंची, नुकीली और अपेक्षाकृत संकरी चोटियों से संकेत मिलता है कि पृथक्करण विधि ने मिश्रण से एक घटक को कुशलतापूर्वक हटा दिया; उच्च दक्षता। दक्षता एचपीएलसी कॉलम और उपयोग की जाने वाली एचपीएलसी विधि पर बहुत निर्भर है। दक्षता कारक प्लेट संख्या और 'सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या' का पर्याय है।

प्रतिधारण कारक (कप्पा प्राइम) यह मापता है कि क्रोमैटोग्राम में अपने शिखर के वक्र के नीचे के क्षेत्र द्वारा मापे गए मिश्रण का एक घटक स्तंभ से कितनी देर तक चिपका रहता है (चूंकि एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम समय का एक कार्य है)। प्रत्येक क्रोमैटोग्राम शिखर का अपना प्रतिधारण कारक होगा (जैसे, कप्पा 1 पहली चोटी के अवधारण कारक के लिए)। इस कारक को स्तंभ के शून्य आयतन द्वारा ठीक किया जा सकता है।

पृथक्करण कारक (अल्फा) एक सापेक्ष तुलना है कि मिश्रण के दो पड़ोसी घटकों को कितनी अच्छी तरह से अलग किया गया था (यानी, क्रोमैटोग्राम पर दो पड़ोसी बैंड)। इस कारक को पड़ोसी क्रोमैटोग्राम चोटियों की एक जोड़ी के प्रतिधारण कारकों के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है, और इसे स्तंभ के शून्य आयतन द्वारा भी ठीक किया जा सकता है। पृथक्करण कारक मान जितना अधिक 1.0 से अधिक होता है, अलगाव उतना ही बेहतर होता है, लगभग 2.0 तक जिसके बाद पृथक्करण के लिए HPLC विधि की आवश्यकता नहीं होती है। रिज़ॉल्यूशन समीकरण तीन कारकों से संबंधित हैं जैसे कि उच्च दक्षता और पृथक्करण कारक एचपीएलसी पृथक्करण में घटक चोटियों के रिज़ॉल्यूशन में सुधार करते हैं।

आंतरिक व्यास
एचपीएलसी कॉलम का आंतरिक व्यास (आईडी) एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो ग्रेडिएंट रेफरेंस में डिटेक्शन सेंसिटिविटी और सेपरेशन सेलेक्टिविटी को प्रभावित करता है। यह विश्लेषण की मात्रा भी निर्धारित करता है जिसे कॉलम पर लोड किया जा सकता है। बड़े कॉलम आमतौर पर औद्योगिक अनुप्रयोगों में देखे जाते हैं, जैसे बाद में उपयोग के लिए दवा उत्पाद की शुद्धि। लो-आईडी कॉलम ने लोडिंग क्षमता की कीमत पर संवेदनशीलता और कम विलायक खपत में सुधार किया है।

बड़े आईडी कॉलम (10 मिमी से अधिक) का उपयोग उनकी बड़ी लोडिंग क्षमता के कारण उपयोगी मात्रा में सामग्री को शुद्ध करने के लिए किया जाता है।

विश्लेषणात्मक पैमाने के स्तंभ (4.6 मिमी) सबसे सामान्य प्रकार के स्तंभ रहे हैं, हालांकि छोटे स्तंभ तेजी से लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं। वे नमूनों के पारंपरिक मात्रात्मक विश्लेषण में उपयोग किए जाते हैं और अक्सर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर | यूवी-विज़ अवशोषक डिटेक्टर का उपयोग करते हैं।

नैरो-बोर कॉलम (1–2 मिमी) का उपयोग अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है जब विशेष यूवी-विज़ डिटेक्टरों, प्रतिदीप्ति पहचान या तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसी अन्य पहचान विधियों के साथ अधिक संवेदनशीलता वांछित होती है।

केशिका स्तंभ (0.3 मिमी से कम) का उपयोग लगभग विशेष रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे वैकल्पिक पहचान साधनों के साथ किया जाता है। वे आमतौर पर स्टेनलेस स्टील टयूबिंग के बजाय फ्युज़्ड सिलिका केशिकाओं से बने होते हैं, जो कि बड़े कॉलम काम करते हैं।

कण आकार
अधिकांश पारंपरिक एचपीएलसी छोटे गोलाकार सिलिकॉन डाइऑक्साइड कणों (बहुत छोटे मोती) के बाहर से जुड़े स्थिर चरण के साथ किया जाता है। ये कण विभिन्न आकारों में आते हैं जिनमें 5 माइक्रोमीटर मोती सबसे आम हैं। छोटे कण आम तौर पर अधिक सतह क्षेत्र और बेहतर अलगाव प्रदान करते हैं, लेकिन इष्टतम रैखिक वेग के लिए आवश्यक दबाव कण व्यास वर्ग के व्युत्क्रम से बढ़ता है। समीकरणों के अनुसार स्तंभ वेग, दक्षता और वापस दबाव, कण व्यास को आधे से कम करना और स्तंभ के आकार को समान रखना, स्तंभ वेग और दक्षता को दोगुना कर देगा; लेकिन चार गुना बैकप्रेसर बढ़ाएं। और छोटे कण एचपीएलसी भी चौड़ाई को कम कर सकते हैं। बड़े कणों का उपयोग प्रारंभिक एचपीएलसी (कॉलम व्यास 5 सेमी से> 30 सेमी तक) और गैर-एचपीएलसी अनुप्रयोगों जैसे ठोस-चरण निष्कर्षण के लिए किया जाता है।

ताकना आकार
अधिक सतह क्षेत्र प्रदान करने के लिए कई स्थिर चरण झरझरा हैं। छोटे छिद्र अधिक सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं जबकि बड़े ताकना आकार में बेहतर कैनेटीक्स होते हैं, विशेष रूप से बड़े विश्लेषणों के लिए। उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन जो एक छिद्र से थोड़ा ही छोटा होता है वह छिद्र में प्रवेश कर सकता है लेकिन एक बार अंदर जाने पर आसानी से बाहर नहीं निकलता है।

पम्प दबाव
पंप दबाव क्षमता में भिन्न होते हैं, लेकिन उनके प्रदर्शन को एक सुसंगत और पुनरुत्पादित वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर प्राप्त करने की उनकी क्षमता पर मापा जाता है। दबाव 60 MPa (6000 पाउंड प्रति वर्ग इंच|lbf/in) तक पहुंच सकता है2), या लगभग 600 वातावरण। आधुनिक एचपीएलसी प्रणालियों को बहुत अधिक दबावों पर काम करने के लिए सुधारा गया है, और इसलिए स्तंभों में बहुत छोटे कण आकार (<2 माइक्रोन) का उपयोग करने में सक्षम हैं। ये अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी सिस्टम या UHPLCs, जिन्हें अल्ट्रा हाई प्रेशर क्रोमैटोग्राफी सिस्टम के रूप में भी जाना जा सकता है, 120 MPa (17,405 lbf/in2), या लगभग 1200 वातावरण। यूपीएलसी शब्द जल निगम  का एक ट्रेडमार्क है, लेकिन कभी-कभी यूएचपीएलसी की अधिक सामान्य तकनीक को संदर्भित करने के लिए उपयोग किया जाता है।

डिटेक्टर
एचपीएलसी डिटेक्टर दो मुख्य श्रेणियों में आते हैं: सार्वभौमिक या चयनात्मक। यूनिवर्सल डिटेक्टर आमतौर पर मोबाइल चरण और मोबाइल चरण के बीच भौतिक संपत्ति के अंतर को मापने के द्वारा थोक संपत्ति (उदाहरण के लिए, अपवर्तक सूचकांक) को मापते हैं, जबकि चुनिंदा डिटेक्टर एक घुलनशील संपत्ति को मापते हैं (उदाहरण के लिए, पराबैंगनी-दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी | यूवी-विज़ अवशोषण) केवल विलेय के भौतिक या रासायनिक गुणों पर प्रतिक्रिया करके। एचपीएलसी आमतौर पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर | यूवी-विज़ अवशोषक डिटेक्टर का उपयोग करता है, हालांकि, अन्य क्रोमैटोग्राफी डिटेक्टरों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है। एक सार्वभौमिक डिटेक्टर जो यूवी-विज़ अवशोषक पहचान को पूरा करता है वह आवेशित एरोसोल डिटेक्टर (सीएडी) है। एक प्रकार के आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले डिटेक्टर में अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर शामिल होते हैं, जो प्रवाह सेल के माध्यम से चलने वाले एल्यूअंट के अपवर्तक सूचकांक में परिवर्तन को मापकर रीडिंग प्रदान करते हैं। कुछ मामलों में, कई डिटेक्टरों का उपयोग करना संभव है, उदाहरण के लिए लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री आम तौर पर मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ यूवी-विज़ को जोड़ती है।

जब एक इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्टर (ईसीडी) के साथ प्रयोग किया जाता है तो एचपीएलसी-ईसीडी चुनिंदा न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाता है जैसे: नोरेपीनेफ्राइन, डोपामाइन, सेरोटोनिन, ग्लूटामेट, जीएबीए, एसिट्लोक्लिन और न्यूरोकेमिकल विश्लेषण अनुसंधान अनुप्रयोगों में अन्य। एचपीएलसी-ईसीडी femtoms रेंज में न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाता है। न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाने के अन्य तरीकों में तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एलिसा, या रेडियोइम्यूनोसेज़ शामिल हैं।

ऑटोसैंपलर
एचपीएलसी ऑटोसैंपलर के उपयोग से बड़ी संख्या में नमूने स्वचालित रूप से एचपीएलसी सिस्टम पर इंजेक्ट किए जा सकते हैं। इसके अलावा, एचपीएलसी ऑटोसैंपलर में एक इंजेक्शन मात्रा और तकनीक होती है जो प्रत्येक इंजेक्शन के लिए बिल्कुल समान होती है, फलस्वरूप वे उच्च स्तर की इंजेक्शन मात्रा सटीकता प्रदान करते हैं। नमूना-कक्ष के भीतर नमूना सरगर्मी को सक्षम करना संभव है, इस प्रकार एकरूपता को बढ़ावा देना।

निर्माण
एचपीएलसी के प्रयोगशाला और नैदानिक ​​विज्ञान दोनों में कई अनुप्रयोग हैं। यह फार्मास्युटिकल विकास में उपयोग की जाने वाली एक सामान्य तकनीक है, क्योंकि यह उत्पाद की शुद्धता प्राप्त करने और सुनिश्चित करने का एक भरोसेमंद तरीका है। जबकि एचपीएलसी बेहद उच्च गुणवत्ता वाले (शुद्ध) उत्पादों का उत्पादन कर सकता है, यह हमेशा थोक दवा सामग्री के उत्पादन में उपयोग की जाने वाली प्राथमिक विधि नहीं होती है। यूरोपीय फार्माकोपिया के अनुसार, एचपीएलसी का उपयोग केवल 15.5% संश्लेषण में किया जाता है। हालांकि, यह संयुक्त राज्य अमेरिका के फार्माकोपिया में 44% संश्लेषण में भूमिका निभाता है। यह संभवतः मौद्रिक और समय की कमी में अंतर के कारण हो सकता है, क्योंकि बड़े पैमाने पर एचपीएलसी एक महंगी तकनीक हो सकती है। एचपीएलसी के साथ होने वाली विशिष्टता, सटीकता और सटीकता में वृद्धि दुर्भाग्य से लागत में वृद्धि से मेल खाती है।

कानूनी
मूत्र में अवैध दवाओं का पता लगाने के लिए भी इस तकनीक का उपयोग किया जाता है। दवा का पता लगाने का सबसे आम तरीका एक इम्यूनोसे है। यह तरीका ज्यादा सुविधाजनक है। हालांकि, सुविधा दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की विशिष्टता और कवरेज की कीमत पर आती है। चूंकि एचपीएलसी शुद्धता निर्धारित करने (और संभवतः बढ़ाने) की एक विधि है, दवाओं की सांद्रता का मूल्यांकन करने में अकेले एचपीएलसी का उपयोग करना कुछ हद तक अपर्याप्त है। इसके साथ, इस संदर्भ में एचपीएलसी अक्सर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संयोजन के साथ किया जाता है। एमएस के साथ संयोजन के रूप में गैस क्रोमैटोग्राफी के बजाय तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग एसिटिलेटिंग या अल्काइलेशन एजेंटों के साथ व्युत्पन्न करने की आवश्यकता को कम करता है, जो एक बोझिल अतिरिक्त कदम हो सकता है। इस तकनीक का उपयोग डोपिंग एजेंट, ड्रग मेटाबोलाइट्स, ग्लूकोरोनाइड कॉन्जुगेट्स, एम्फ़ैटेमिन, ओपिओइड, कोकीन, बीजेडडी, केटामाइन, एलएसडी, कैनबिस और कीटनाशक जैसे विभिन्न प्रकार के एजेंटों का पता लगाने के लिए किया गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संयोजन के साथ एचपीएलसी प्रदर्शन करने से एचपीएलसी प्रायोगिक रन के मानकीकरण की पूर्ण आवश्यकता कम हो जाती है।

अनुसंधान
इसी तरह के परीक्षण अनुसंधान उद्देश्यों के लिए किए जा सकते हैं, एंटी-फंगल और अस्थमा दवाओं जैसे संभावित नैदानिक ​​​​उम्मीदवारों की सांद्रता का पता लगा सकते हैं। यह तकनीक स्पष्ट रूप से एकत्रित नमूनों में कई प्रजातियों को देखने में उपयोगी है, लेकिन जब प्रजातियों की पहचान के बारे में जानकारी मांगी जाती है तो मानक समाधानों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यह संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के परिणामों की पुष्टि करने के लिए एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है, क्योंकि इस प्रकार के शोध में शुद्धता आवश्यक है। हालांकि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री अभी भी प्रजातियों की पहचान करने का अधिक विश्वसनीय तरीका है।

चिकित्सा
एचपीएलसी के चिकित्सा उपयोग में दवा विश्लेषण शामिल हो सकता है, लेकिन पोषक विश्लेषण की श्रेणी में अधिक बारीकी से आता है। जबकि दवा सांद्रता का विश्लेषण करने के लिए मूत्र सबसे आम माध्यम है, रक्त सीरम एचपीएलसी के साथ अधिकांश चिकित्सा विश्लेषणों के लिए एकत्र किया गया नमूना है। क्लिनिकल अध्ययन के लिए उपयोगी अणुओं का पता लगाने के अन्य तरीकों का एचपीएलसी के खिलाफ परीक्षण किया गया है, अर्थात् इम्यूनोसेज़। इसके एक उदाहरण में, प्रतिस्पर्धी प्रोटीन बाध्यकारी जांच (सीपीबीए) और एचपीएलसी की तुलना विटामिन डी का पता लगाने में संवेदनशीलता के लिए की गई थी। बच्चों में विटामिन डी की कमी के निदान के लिए उपयोगी, यह पाया गया कि इस सीपीबीए की संवेदनशीलता और विशिष्टता केवल 40% और 60% तक पहुंच गई। एचपीएलसी की क्षमता का क्रमशः%। जबकि एक महंगा उपकरण, एचपीएलसी की सटीकता लगभग अद्वितीय है।

यह भी देखें

 * क्रोमैटोग्राफी का इतिहास
 * केशिका इलेक्ट्रोक्रोमैटोग्राफी
 * कॉलम क्रोमैटोग्राफी
 * साबा होर्वथ (केमिकल इंजीनियर)|साबा होर्वथ
 * आयन क्रोमैटोग्राफी
 * माइक्रेलर तरल क्रोमैटोग्राफी

अग्रिम पठन

 * L. R. Snyder, J.J. Kirkland, and J. W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley & Sons, New York, 2009.
 * M.W. Dong, Modern HPLC for practicing scientists. Wiley, 2006.
 * L. R. Snyder, J.J. Kirkland, and J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Sons, New York, 1997.
 * S. Ahuja and H. T. Rasmussen (ed), HPLC Method Development for Pharmaceuticals, Academic Press, 2007.
 * S. Ahuja and M.W. Dong (ed), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, Elsevier/Academic Press, 2005.
 * Y. V. Kazakevich and R. LoBrutto (ed.), HPLC for Pharmaceutical Scientists, Wiley, 2007.
 * U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997.
 * M. C. McMaster, HPLC, a practical user's guide, Wiley, 2007.

बाहरी संबंध
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 * HPLC Chromatography Principle, Application [Basic Note – 2020. ] at Rxlalit.com